CTGAG
[0182]miR-189 SEQ N0.12(5，— 3，方向)
[0183]UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU
[0184]上游引物SEQ N0.13(5’ 一 3’ 方向)
[0185]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)AACTCAGTAATG
[0186]下游引物SEQ N0.14(5’ 一 3’ 方向)
[0187]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)A+AACCGTTACC
[0188]miR-451 SEQ N0.15(5，— 3，方向)
[0189]AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
[0190]上游引物SEQ N0.16(5’ 一 3’ 方向)
[0191]NH2-tttttttttt(VIC)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)AACTATACAACC
[0192]下游引物SEQ N0.17(5’ 一3’ 方向)
[0193](VIC)CCGATCTAGTGGATCtgttcttTGAGGT(BHQl)+AGGAG
[0194]let-7e SEQ N0.18(5’ 一 3’ 方向)
[0195]UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU。
[0196]2.不同靶分子对应的上游引物和/或下游引物固定于固相芯片
[0197]采用本发明所属技术领域公知的技术方法，利用微细加工技术，制备含有3个微反应孔的固相芯片，通过上游引物和/或下游引物的Poly(Tw)的5’-末端氨基基团和固相芯片微反应孔的羧基基团的化学耦联，将引物固定于固相芯片的微反应孔，其中:
[0198]miR-105靶分子对应的上游引物SEQ N0.1和miR_26a靶分子对应的上游引物SEQN0.4同时固定于固相芯片的第一个微反应孔，二者的引物分别标记FAM和VIC焚光报告分子;
[0199]miR-16靶分子对应的下游引物SEQ N0.8和miR-189靶分子对应的下游引物SEQN0.11同时固定于固相芯片的第二个微反应孔，二者的引物分别标记FAM和VIC荧光报告分子;
[0200]miR-451靶分子对应的上游引物SEQ N0.13和下游引物SEQ N0.14、miR_7e靶分子对应的上游引物SEQ N0.16和下游引物SEQ N0.17均同时固定于固相芯片的第三个微反应孔，二者的引物分别标记FAM和VIC焚光报告分子。
[0201]3.血清总RNA的提取
[0202]采用商品化总RNA提取试剂盒提取10例人体外周血白细胞总RNA。
[0203]4.固相芯片恒温指数扩增体系的构建
[0204]反应体系共计50 μ L，该体系包括以下组分:50mM NaClUOmM Tris-HClUOmMMgCl2UOO μ g/ml BSA、0.5 单位 Klenow(exo-)DNA 聚合酶(NEB)、2 单位 Nt.AlwI 缺 P 酶(NEB) ,600 μΜ dNTPs (Promega)、步骤I和2中未固定于固相芯片的上游和/或下游引物为每种引物50nM，步骤2中固定了上游和/或下游引物的固相芯片，靶分子是合成的0.1zmol的miRNA靶分子(包括:SEQ N0.3^ SEQ N0.6^ SEQ N0.9^ SEQ N0.12、SEQ N0.15^ SEQ N0.18)，或者是步骤3制备的10例人体外周血白细胞总RNA。
[0205]4.靶分子的扩增与荧光检测
[0206]将上述制备的反应体系置于ViiA7实时荧光定量PCR，反应条件为:37°C 30分钟。反应完毕后，采用北京博奥公司的微阵列芯片扫描仪检测固相芯片每个微反应孔的荧光种类与强度。
[0207]5.检测结果与分析
[0208]5.1当反应体系中只有miR-105靶分子时，只有固相芯片的第一个微反应孔固定引物释放的可检测FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0209]5.2当反应体系中只有miR_26a靶分子时，只有固相芯片的第一个微反应孔固定引物释放的可检测VIC荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0210]5.3当反应体系中只有miR-16靶分子时，只有固相芯片的第二个微反应孔固定引物释放的可检测FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0211]5.4当反应体系中只有miR-189靶分子时，只有固相芯片的第二个微反应孔固定引物释放的可检测VIC荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0212]5.5当反应体系中只有miR-451靶分子时，只有固相芯片的第三个微反应孔固定引物释放的可检测FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0213]5.6当反应体系中只有miR_7e靶分子时，只有固相芯片的第三个微反应孔固定引物释放的可检测VIC荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0214]5.7当反应体系中同时存在本实施例所述的6种靶分子时，固相芯片的每一个至第三个微反应孔均可检测到固定引物释放的FAM和VIC荧光信号，且荧光信号的强度与各靶分子的初始浓度成正比。
[0215]5.8临床样本的检测结果表明，10例样本的miR-105、miR_26a、miR-16, miR-189,miR-451、miR-7e 检测结果分别是 5.23 ?7.28 X ΙΟ3、1.27 ?4.38Χ104、2.13 ?3.24 X ΙΟ4、6.23 ?8.23Χ 103、4.23 ?6.89X 140
[0216]5.9相对于现有的基于杂交的固相芯片检测方法，本实施例是核酸扩增与检测为一体的检测方法，可在30分钟内完成核酸扩增，扩增产物可直接用于相关设备检测，无需后续的杂交步骤，总体耗时仅40分钟左右，远远低于现有的基于杂交的类似检测方法，并且，其灵敏度和特异性等方法学参数与现有类似检测方法具有良好的相关性。
【主权项】
1.微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:包括反应混合物，反应混合物包括以下反应成分: ①具有3’-端羟基的miRNA靶分子； ②上游引物和下游引物； ③DNA聚合酶； ④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂； ⑤三磷酸脱氧核苷酸； ⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系； 所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5’ 一3’碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3’ -端序列互补； 所述的上游引物和下游引物具有靶分子特异性，每种靶分子特异性的上游引物和/或下游引物通过其5’-末端固定于固相芯片，并且，固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物在其缺口剂识别序列的两侧分别标记具有荧光共振能量转移作用的荧光报告分子和淬灭分子。2.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的每种靶分子特异性的上游引物和下游引物同时固定于固态芯片的一个特定位点； 或者，每种靶分子只有其具有特异性的上游引物固定于固态芯片的一个特定位点； 或者，每种靶分子只有其具有特异性的下游引物固定于固态芯片的一个特定位点； 或者，固相芯片的同一个特定位点同时固定一种或以上靶分子特异性的上游引物和另一种或以上其它靶分子特异性的下游引物。3.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的固相芯片包括微阵列或微珠，以及基于微流体、微流控或微制造工艺产生的具有多个微反应孔的生物芯片。4.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的固定于固相芯片的上游引物和/下游引物的锚定序列区5’-端增加多聚碱基，包括多聚胞腺嘧啶碱基(Poly(Tn))或多聚腺嘌呤碱基(Poly(An)),并通过所述多聚碱基的5’-末端固定于固相芯片。5.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:靶分子特异性上游引物和/或下游引物通过其5’ -末端直接或间接固定于固相芯片，固定的方式包括以共价键和非共份键的结合方式固定，或者，通过物理吸附和/或化学耦联方式固定，或者，具有胺基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定，或者，具有硫醇基的烷基或者芳基化合物作为连接肽固定引物，或者，通过手臂分子固定。6.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:固定于不同固相芯片的不同靶分子的特异性上游引物和/或下游引物标记具有荧光共振能量转移作用的相同焚光报告分子和淬灭分子； 或者，固定于相同固相芯片的不同靶分子的特异性上游引物和/或下游引物标记具有焚光共振能量转移作用的不同焚光报告分子和淬灭分子。7.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述miRNA靶分子的特异性上游引物和/或下游引物的锚定序列区和/或识别序列区引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基。8.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述miRNA靶分子的特异性上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子及其互补序列3’ -末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸； 或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括Taq MutS,RecA09.如权利要求1所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶； 或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。10.如权利要求1至9中任意一项所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的恒温的反应温度范围为37-70°C。11.如权利要求10所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的恒温的反应温度为37 °C、55 °C、60 °C或65 °C。12.如权利要求1至9中任意一项所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的反应时间为10-80min。13.如权利要求12所述的微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于:所述的反应时间为 10min、20min、30min、40min、50min 或 60min。14.如权利要求1至9、11、13中的任意一项所述的利用微小RNA的固相芯片恒温检测方法的检测试剂和试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种微小RNA的固相芯片恒温检测方法，靶分子特异性的上游引物和下游引物，其锚定序列区含有缺口剂识别序列正义链序列，识别序列区则分别与miRNA及其互补链的3ˊ-端序列互补，可在缺口剂和DNA聚合酶协同作用下分别介导一个既独立又相互作用的“切割-延伸-链置换”恒温线性扩增，最终实现恒定温度条件下指数扩增miRNA，通过将荧光报告分子和淬灭分子标记的上游和/或下游引物固定在固相芯片，可通过检测荧光信号实现多种靶分子的高通量检测。本发明克服了miRNA固有属性对其扩增检测方法的设计难度，提供一种基于寡核苷酸引物的液态恒温指数扩增与检测系统，能够在恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增与检测的方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105063190
【申请号】CN201510460239
【发明人】黄庆, 府伟灵, 黄君富, 夏涵
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月30日