3]下游引物SEQ N0.11 (5，—3’ 方向)
[0114]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)TGCC+TAC+TG+AG
[0115]miR-189 SEQ N0.12(5，— 3，方向)
[0116]UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU
[0117]上游引物SEQ N0.13(5’ 一3’ 方向)
[0118]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+ACTC+AGT+AATG
[0119]下游引物SEQ N0.14(5’ 一 3’ 方向)
[0120](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+A+ACCGT+TACC
[0121]miR-451 SEQ N0.15(5’ 一 3’ 方向)
[0122]AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
[0123]上游引物SEQ N0.16(5’ 一 3’ 方向)
[0124](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+ACTA+TACA+ACC
[0125]下游引物SEQ N0.17(5’ 一3’ 方向)
[0126](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)TG+AGGT+AGG+AG
[0127]let-7e SEQ N0.18(5’ 一 3’ 方向)
[0128]UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU。
[0129]2.不同靶分子对应的上游引物和/或下游引物固定于固相芯片的特定位点
[0130]采用本发明所属技术领域公知的技术方法，如图6所示，通过上游引物和/或下游引物的Poly0\。)的5’-末端氨基基团和固相芯片的羧基基团的化学耦联，将引物固定于固相芯片表面的特定位点，其中:
[0131]miR-105靶分子对应的上游引物SEQ N0.1固定于固相芯片的第一列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性；
[0132]miR-26a靶分子对应的上游引物SEQ N0.4固定于的第二列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性；
[0133]miR-16靶分子对应的下游引物SEQ N0.8固定于的第三列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性；
[0134]miR-189靶分子对应的下游引物SEQ N0.11固定于的第四列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性；
[0135]miR-451靶分子对应的上游引物SEQ N0.13和下游引物SEQ N0.14同时固定于的第五列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性；
[0136]miR-7e靶分子对应的上游引物SEQ N0.16和下游引物SEQ N0.17同时固定于的第六列三个重复的特定位点，三个重复的特定位点的目的是提高检测结果的准确性与重复性。
[0137]并且，固定在固相芯片的上述所述上游和/或下游引物均在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有PE焚光报告分子和BHQ3淬灭分子。
[0138]3.血清总RNA的提取
[0139]采用商品化总RNA提取试剂盒提取10例人体外周血白细胞总RNA。
[0140]4.固相芯片恒温指数扩增体系的构建
[0141]反应体系共计50 μ L，该体系包括以下组分:20mM Tris_HCl、1mM(NH4)2S04、50mMKCl、8mM MgS04、0.1% Tween-20、100 μ g/ml BSA、5% DMS0、0.2 单位 VentR (exo_) DNA 聚合酶(NEB)、1.6 单位 Nt.BstNBI 缺 P 酶(NEB)、1.5 μ g 耐热错配识别蛋白 Taq MutS (NipponGene)、600 μM dNTPs (Promega)、步骤I和2中未固定于固相芯片的上游和/或下游引物为每种引物50nM，步骤2中表面固定了上游和/或下游引物的固相芯片，靶分子是合成的
0.1zmol 的 miRNA 革巴分子(包括:SEQ N0.3、SEQ N0.6、SEQ N0.9、SEQ N0.12、SEQ N0.15、SEQ N0.18)，或者是步骤3制备的10例人体外周血白细胞总RNA。
[0142]4.靶分子的扩增与荧光检测
[0143]将上述制备的反应体系置于Vi iA7实时荧光定量PCR，反应条件为:60°C 40分钟。反应完毕后，采用北京博奥公司的微阵列芯片扫描仪检测固相芯片每个特定位点的荧光。
[0144]5.检测结果与分析
[0145]5.1当反应体系中只有miR-105靶分子时，只有第一列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0146]5.2当反应体系中只有miR_26a靶分子时，只有第二列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0147]5.3当反应体系中只有miR-16靶分子时，只有第三列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0148]5.4当反应体系中只有miR-189靶分子时，只有第四列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0149]5.5当反应体系中只有miR-451靶分子时，只有第五列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0150]5.6当反应体系中只有miR_7e靶分子时，只有第六列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与该靶分子的初始浓度成正比。
[0151]5.7当反应体系中同时存在本实施例所述的6种靶分子时，第一列至第六列的三个重复的特定位点能够检测到FAM荧光信号，且荧光信号的强度与各靶分子的初始浓度成正比(图6)。
[0152]5.8临床样本的检测结果表明，10例样本的miR-105、miR_26a、miR-16, miR-189,miR-451、miR-7e 检测结果分别是 5.23 ?7.28 X ΙΟ3、1.27 ?4.38Χ104、2.13 ?3.24 X ΙΟ4、6.23 ?8.23Χ 103、4.23 ?6.89X 140
[0153]5.9相对于现有的基于杂交的固相芯片检测方法，本实施例是核酸扩增与检测为一体的检测方法，可在40分钟内完成核酸扩增，扩增产物可直接用于相关设备检测，无需后续的杂交步骤，总体耗时仅50分钟左右，远远低于现有的基于杂交的类似检测方法，并且，其灵敏度和特异性等方法学参数与现有类似检测方法具有良好的相关性。
[0154]实施例二:固相芯片的每个特定位点固定两种miRNA革El分子对应的上游引物和/或下游引物，在一张固相芯片中同时检测6种miRNA革El分子
[0155]在引物的固相芯片固定方面，为了增加其简易性，在固定引物的本发明所述锚定序列区的5’-端引入10个连续的多聚T碱基(Poly(T1J),并通过Poly (1\。) 5’-末端的氨基与固相芯片的羧基的化学耦联实现引物在固相芯片的固定。本实施例所采用的化学耦联、固相芯片、固相芯片的荧光检测均是本发明所在技术领域的公知技术与方法。
[0156]1.靶分子特异性引物的设计与合成
[0157]SEQ N0.1和SEQ N0.2分别是扩增miRNA靶分子miR-105 (SEQ N0.3)的上游引物和下游引物，SEQ N0.4和SEQ N0.5分别是扩增miRNA靶分子miR_26a(SEQ N0.6)的上游引物和下游引物，SEQ N0.7和SEQ N0.8分别是扩增miRNA革巴分子miR-16 (SEQ N0.9)的上游引物和下游引物，SEQ N0.10和SEQ N0.11分别是扩增miRNA靶分子miR-189 (SEQ N0.12)的上游引物和下游引物，SEQ N0.13和SEQ N0.14分别是扩增miRNA靶分子miR-451 (SEQ N0.15)的上游引物和下游引物，SEQ N0.16和SEQ N0.17分别是扩增miRNA革巴分子miR_7e (SEQN0.18)的上游引物和下游引物。
[0158]各引物5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.AlwI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GGATC-3，)的锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子(SEQ N0.3、SEQ N0.6、SEQ N0.9、SEQ N0.12、SEQ N0.15、SEQ N0.18)及其互补链的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子及其互补链的3’ -末端序列互补，并在部分引物的识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。对于固相芯片的固定引物，包括 SEQ N0.USEQ N0.4^SEQ N0.8^SEQ N0.1USEQ N0.13、SEQ N0.14、SEQN0.16、SEQ N0.17，均在上述引物的锚定序列区的5’-末端引入Poly (Tiq)，并在Poly (Tiq)的5’-末端修饰氨基基团。
[0159]上述所有寡核苷酸分子均由专业公司合成。
[0160]上游引物SEQ N0.1 (5，— 3’ 方向)
[0161](FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttcttACC(BHQl)ACAGGAG
[0162]下游引物SEQ N0.2 (5，—3’ 方向)
[0163]CCGATCTAGTGGATCtgttcttTCAAATGC+TCA
[0164]miRNA-105 SEQ N0.3 (5，— 3’ 方向)
[0165]UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
[0166]上游引物SEQ N0.4(5’ 一 3’ 方向)
[0167]NH2-tttttttttt(VIC)CCGATCTAGTGGATCtgttcttAGCCT(BHQl)A+TCCTG
[0168]下游引物SEQ N0.5(5’ 一 3’ 方向)
[0169]CCGATCTAGTGGATCtgttcttTTCAAGTAAT
[0170]miR-26a SEQ N0.6 (5，— 3’ 方向)
[0171]UUCAA⑶AAUCCAGGAUAGGCU
[0172]上游引物SEQ N0.7(5’ 一 3’ 方向)
[0173]CCGATCTAGTGGATCtgttcttCGCCAATATT
[0174]下游引物SEQ N0.8(5’ 一 3’ 方向)
[0175]NH2-tttttttttt(FAM)CCGATCTAGTGGATCtgttctt(BHQl)TAGCAGCACGT
[0176]miR-16 SEQ N0.9 (5，— 3’ 方向)
[0177]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
[0178]上游引物SEQ N0.10(5，— 3’ 方向)
[0179]CCGATCTAGTGGATCtgttcttACTGA+TATCAG
[0180]下游引物SEQ N0.11 (5，—3’ 方向)
[0181]NH2-tttttttttt(VIC)CCGATCTAGTGGATCtgttcttTGCCT(BHQl)A