一种小球藻多糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种小球藻多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002] 小球藻（Chlorellaspp.)为一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门（Chlorphyta) 绿藻纲（Chlo-rophyceae)绿球藻目（ChlorocOccales)卵囊藻科（Oocystaceae)球藻属 (Chlorella)。现世界上已知的小球藻有15种之多。小球藻体内含有丰富的生物活性物 质，如不饱和脂肪酸、色素、蛋白质、多糖等，具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒，防治消化性溃疡和 缺铁性贫血、抗高血脂症和动脉粥样硬化、抗辐射、解毒保肝和降低血压等多种功能。小球 藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h 增长4倍的生物，具有很高的应用价值。目前小球藻已经广泛地应用在动物饲料、食品添加 剂、医药制剂、美容产品等方面。大量研究证明，小球藻多糖的生物活性多样，具有抗菌、增 强免疫力功能、降血糖以及较为显著的抗癌、抗肿瘤活性已成为关注的热点。传统的多糖提 取方法主要有：水提醇沉法、酸提法和碱提法、热水抽提法，传统高温、酸性、碱性提取条件 下，可导致多糖降解，并且会使粗多糖的样品颜色变深，杂质较多。近年来超临界流体萃取 法成为一种新的提取分离技术，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。但是设备 复杂，运行成本高，提取范围窄。因而没有被广泛应用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于现有技术的不足，提供一种能耗低、生产成本低、小球藻多糖 提取率、回收率尚的提取方法。
[0004] 本发明采用的技术方案如下：
[0005] -种小球藻多糖的提取方法，其提取方法如图1。
[0006] -种小球藻多糖的提取方法，其具体操作步骤如下：
[0007] 1、预处理：将小球藻粉加水配制成浓度为5 %~10 %混悬液，置于60°C水浴箱中 Ih并不断搅拌；
[0008] 2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经~20°C冷冻，室温下解冻。重复冻融过 程4次，每次冷冻12h;后加入3~5mL、pH7. 0、浓度为0.Olmol/L磷酸缓冲液，超声波处理 (400~600W，时间4~6min)，于2000~2500r/min条件下离心5min,过滤，滤液备用；
[0009] 3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加水配制成10~20%溶液，加入胰蛋白酶,酶解温度 均为50~60°C，酶解时间2h;离心，转速控制为3000~4000r/min，时间为lOmin，过滤，滤 液备用；所述的胰蛋白酶活性为3000U/mg;所述的滤液：胰蛋白酶重量之比为100:0. 5 ;
[0010] 4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并混匀，减压浓缩至滤液体积的 十分之一，即得浓缩液，加入95%的无水乙醇混合均勾，置于摇床30~45min;，4000~ 5000r/min条件下离心IOmin,弃去上清液，即得粗多糖；所述的浓缩液：95%无水乙醇重量 比为1:2;
[0011] 5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80%的三氯乙酸调节pH值为 4. 0~6. 0,静置12~18h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
[0012] 本发明的优势在于：本发明采用冻融法是低温冷冻与室温融化交替进行的一种 破壁方法，促使细胞完全破裂的同时避免了高温对原料所造成的营养损失、有效成分破坏 严重的不良影响。同时超声波辅助提取小球藻多糖，机械作用也加速细胞壁的破碎，促进胞 内多糖活性物质的快速溶出。与传统多糖提取相比，交替冻融破壁和超声波辅助提取有效 结合，具有能耗低、多糖提取率、回收率高，生产成本低的特点。通过本发明冻融联合超声 波提取方法，小球藻多糖提取率、回收率分别是传统提取方法的1. 34~1. 39倍以及I. 1~ 1. 58 倍。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明提取小球藻多糖的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1
[0015] 1、预处理：称取100g小球藻粉溶于500ml蒸馏水中配制成浓度为5%混悬液，置 于60°C水浴箱中Ih并不断搅拌；
[0016] 2、冻融、超声波处理：将小球藻混悬液，经~20°C冷冻，室温下解冻。重复冻融 过程4次，每次冷冻12h;后加入3mL、pH7. 0、浓度为0.Olmol/L磷酸缓冲液，超声波处理 (400W，时间4min)，于2000r/min超速离心机中离心5min,过滤，滤液备用；
[0017] 3、酶解滤渣：将步骤2中滤渣加蒸馏水200ml配制成10%溶液，加入胰蛋白酶 I. 0ml，酶解温度60°C，酶解时间2h，离心，转速控制为4000r/min，时间为lOmin，过滤，滤液 备用；
[0018] 4、减压浓缩与醇析：将步骤2与步骤3中滤液合并减压浓缩至70ml，加入 140ml95%的无水乙醇混合均勾，置于摇床30min;，5000r/min条件下离心IOmin,弃去上 清液，即得粗多糖；
[0019] 5、多糖纯化：将粗多糖，溶入250mL蒸馏水中，用80%的三氯乙酸调节pH值为 6. 0,静置16h，8000r/min条件下离心5min，取上清液；冷冻干燥，即得多糖。
[0020] 小球藻多糖不同提取方法提取率测定试验
[0021] 1、材料与方法
[0022] 小球藻藻粉：江苏明天生物科技有限公司
[0023] 2、小球藻多糖提取方法
[0024] 取100g小球藻粉，以蒸馏水500ml，分别采用如下：
[0025] 1)、连续加热回流提取（索氏提取器）：每次提取2h，提取2次，合并提取液；
[0026] 2)、超声波提取：超声30min，热水回流提取2h，提取2次，合并提取液；
[0027]3)、闪式提取器提取：闪式破碎lOmin，提取2次，合并提取液；
[0028]4)、冻融+超声波提取：提取方法同本发明实施例1 一致；
[0029] 3、小球藻多糖含量测定方法
[0030] 3. 1粗多糖提取率测定
[0031] 采用苯酸~硫酸法测定，用葡萄糖为标准物，在490nm波长处测定标准物质量浓 度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定。用牛血清 蛋白作为标准物，在595nm波长测定标准物质量浓度与吸光度的对应关系，制备标准曲线。 [0032] 3.Ll粗多糖提取率％ =(粗多糖质量/小球藻粉质量）X100%
[0033] 3. 2多糖纯化
[0034] 取I.Og粗多糖，溶入200mL蒸馏水中，用80%的三氯乙酸调节pH值6,静置12h， 离心，取上清