抗菌星型聚多肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗菌材料技术领域，特别涉及抗菌星型聚多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素类抗菌剂的滥用会导致超级抗药菌的生成，且会随着皮肤渗透或血液循环 到未被细菌感染的器官，从而造成毒副作用。因此，如何利用新型抗菌剂替代传统的抗生素 类抗菌剂一直以来都是全球性的科学课题。
[0003] 二十世纪九十年代，生物学家在用微生物诱导天蚕蛹时发现天蚕蛹的免疫系统产 生了一种多肽类物质，该多肽物质具有杀菌活性。科学家命名此多肽为天蚕素（Cecmpins)， 天蚕素作为世界上第一个抗菌肽正式被人们所认识。天然抗菌肽的氨基酸残基数目一般为 15-50个，并且具有加热后稳定性高，在水中溶解性较好等优点。天然抗菌肽受到人们的关 注正是因为它们具有的独特功能，比如有些天然抗菌肽能够对细菌、病毒、真菌、原生动物 等具有较强的抑制作用，而且部分天然抗菌肽在杀灭癌细胞的同时又对真核细胞毒副性较 小。但目前天然抗菌肽依然存在来源有限（天然提取资源有限，难以产业化）、成本高、提取 工艺复杂、容易被酶降解等问题。
[0004] 人工广谱高分子抗菌剂是一种带有大量表面正电荷的高分子，它可以通过静电相 互作用靶向地与细菌的细胞膜结合并插入细胞膜内，造成细菌细胞膜的解体。由于高分子 抗菌剂直接作用于细菌的细胞膜表面而并非像传统的抗生素一样作用于细菌的DNA，所以 其不会造成超级抗药菌的产生（WordNotesonAntibiotics, 2009，V〇1,No. 4)，且对于野 生菌种和耐药性菌种均有效果。另外，由于人体的正常细胞表面的负电荷要远远少于细菌 表面的负电荷，因此其不会破坏人体的正常细胞。同时，高分子抗菌剂不会通过渗透作用进 入皮肤或者细胞膜内，因此无毒副作用，是一种理想的传统抗生素替代品。
[0005] 非线形聚丙烯酸酯类聚合物，由于其较大的表面正电荷密度以及其较高的分子链 柔性，更加容易与细胞膜特异性结合并使细菌细胞膜解体，是一种高效靶向的广谱高分子 抗菌剂。且其合成方法简单，有望被大规模生产。因此，提供一种星型聚多肽及其制备方法 和其用作抗菌剂的用途。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种星型聚多肽、其制备方法及用途。以NCA聚合为手段， 合成三臂星形聚多肽，相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法，其施行简单，提纯 方便，且其产率高达到96%。和已有的产品相比价格低，因此是目前合成三臂星形聚多肽最 行之有效的方法。本方法合成的三臂星形聚多肽分子量较窄，PDI(分子量分布）只有1.1， 合成的星形聚多肽与天然多肽分子结构基本一致，可作为生物医用级抗菌剂给人类使用。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种三臂星型聚多肽，其结构如式I所示
[0009]
[0012]n= 50 ~200。
[0013]星形聚多肽类聚合物，由于其表面正电荷密度较大以及具有较好的生物相容性， 因此更容易与细菌的细胞膜特异性结合并使细菌细胞膜解体，是一种高效靶向的广谱高分 子抗菌剂。所合成的聚多肽，与天然多肽分子结构基本一致，可作为医用级抗菌剂给人类使 用。
[0014] 现今合成星形聚合物的方法主要有核优先法和臂优先法。而这些合成方法往往需 要通过活性聚合来实现，阴离子聚合、阳离子聚合及活性自由基聚合均可合成出分子结构 可控的星形聚合物。
[0015]N-羧基-a-氨基酸酐聚合方法（NCA聚合方法）是生物化学方面非常重要的一个 反应，是现今为止唯一一种通过一步法即可得到聚氨基酸的反应。这种方法相比于现今常 用的固相合成法，其合成成本大大降低；相比于微生物合成法，其避免了复杂的提纯过程。 NCA聚合机理上属于阴离子开环聚合，可以通过四种模式引发反应，即伯胺引发、叔胺引发、 金属化配位合物引发已经硅-氮化合物引发。其中伯胺引发的NCA聚合符合活性聚合特 征，可以使得到的聚氨基酸带有末端基团，方便聚多肽链的修饰，并可通过末端基团进行复 杂高分子链的构筑，是一种合成聚多肽的反应。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽，其结构如式II 所示
[0017]
[0018] 其中，n= 50 ~200。
[0019] 本发明还提供了所述三臂星型聚多肽的制备方法，取炔丙胺、苄基氨基甲酸酯保 护的N-羧基-a-赖氨酸酐与DMSO发生聚合反应，在水中沉淀，获得第一产物；取所述中间 产物、DMF、三功能度叠氮核、CuBr、五甲基二亚乙基三胺通氮气反应，在水中沉淀，获得第二 产物，通过钯碳催化进行还原加氢反应，透析、除水、真空干燥。
[0020] 具体为：
[0021] 当采用臂优先法时，其特征为：利用单功能NCA引发剂，首先通过NCA聚合的手段 合成末端带有炔基的线形聚合物，再通过点击化学反应，利用聚多肽末端的炔基与三功能 度的叠氮核核进行耦合，合成分子结构可控的三臂星形聚多肽，最后通过钯碳催化加氢法 脱掉苄基氨基甲酸酯的保护。
[0022] 反应方程式如下：
[0023]
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法 中，所述第一产物、DMF:三功能度叠氮核：CuBr:五甲基二亚乙基三胺按照物质的量比为 1:(50 ~200):0? 1:0. 3:0. 3。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中， 所述聚合反应在氮气环境下发生。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中， 所述聚合反应的时间为60h~70h;所述通氮气反应的时间为2~4h。
[0029] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的制备方法中， 所述第二产物与氢气的物质的量的比为1:3000。
[0030] 本发明还提供了所述制备方法制得的三臂星型聚多肽。
[0031] 本发明还提供了所述三臂星型聚多肽在制备抗菌剂中的应用。
[0032] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中，所述 抗菌剂用于抑制细菌。
[0033] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中，所述 抗菌剂用于抑制革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[0034] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中，所述 革兰氏阴性菌为大肠杆菌。大肠杆菌可以为普通野生大肠杆菌，还可以为抗药性大肠杆菌。
[0035] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的三臂星型聚多肽的应用中，所述 革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可以为普通野生金黄色葡萄球菌，还可 以为抗药性金黄色葡萄球菌。
[0036] 本发明提出基于臂优先法（arm-first法）聚多肽类人工光谱抗菌剂的制备方法 及其抗菌用途。并以NCA聚合为手段，通过调控引发剂和单体的比例可控合成出生物医用 级的聚多肽类的人工高分子广谱抗菌剂。提出一种可取代传统抗生素的新型高分子抗菌 剂。利用侧基带有氨基的三臂的星形聚合物作为高分子抗菌剂，可以靶向进攻细菌细胞膜 却不破坏人体正常细胞，且具有非常好的抗菌效果。以解决目前现有的高分子抗菌剂往往 是一些天然的多肽，其产量低、价格高，且在人体中易被酸或蛋白酶水解，因此往往难以被 大规模应用的问题。
[0037] 本发明制备方法与现有技术相比具有以下优点：
[0038] 1.本方法采用臂优先法（arm-first法），并以NCA聚合为手段，合成三臂星形聚 多肽，相比于其它方法如固相合成法或用微生物合成法，其施行简单，提纯方便，且其产率 高（达到95%)，中国专利（CN1635010A)报道的一种高分子抗菌剂只有50%-80%的产率。 和已有的产品相比价格低，因此是目前合成三臂星形聚多肽最行之有效的方法。
[0039] 2.本方法合成的三臂星形聚多肽分子量较窄，roi(分子量分布）只有1. 1，合成 的星形聚多肽与天然多肽分子结构基本一致，可作为生物医用级抗菌剂给人类使用。
[0040] 本发明制备方法与现有技术相比还具有以下优点：
[0041] 1.与现有的天然高分子抗菌剂相比，人工合成的聚多肽类产品产量高、价格低、更 易于合成。
[0042] 2.非线形的分子结构可以提供更加高的表面正电荷密度，有利于高分子抗菌剂与 细菌表面的细胞膜特异性结合，从而大幅提高抗菌效率。
[0043] 3.本产品具有广谱抗菌型，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有效。
[0044] 4.本产品直接使细菌细胞膜解体，不会产生抗药的超级细菌，且对于耐药菌种有 很好的效果。
[0045] 5.本产品分子结构与天然多肽极为类似，不会随人体皮肤毛孔和血液循环渗透入 人体正常细胞，对人体毒副作用极小。
【附图说明】
[0046] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0047] 图1示本发明制备的三臂星形聚多肽的反应方程式；
[0048] 图2示本发明实施例1中的三臂星形聚多肽核磁共振氢谱图；
[0049] 图3示本发明实施例1中苄基氨基甲酸酯保护的星形聚多肽凝胶渗透色谱曲线； 纵坐标为信号强度，没有单位；分子量为15000,PDI分布为I. 1说明可控合成比较有效果；
[0050] 图4示本发明提供的三臂星形聚多肽的浓度和杀菌效果曲线；在产物浓度大于 4yg/ml时，对普通野生大肠杆菌杀灭为99. 99%，对抗药性大肠杆菌杀灭为99% ;