使用多重细胞信号传导途径活性的治疗应答的医学预后和预测的制作方法
【专利说明】使用多重细胞信号传导途径活性的治疗应答的医学预后和 预测 发明领域
[0001] 本文描述的主题主要涉及生物信息学、基因组处理领域、蛋白质组学处理领域和 相关领域。
[0002] 发明背景 基因组和蛋白质组学分析已基本实现，且提出医学领域例如肿瘤学中的临床应用的潜 在希望，其中多种癌症已知与基因组突变/变异/异常甲基化模式的特异性组合和/或特 异性基因的高或低表达水平相关，所述特异性基因在癌症的生长和进化例如细胞增殖和转 移中起作用。例如，Wnt信号传导途径影响细胞增殖的调节，并且是高度调节的。由于调节 丧失导致的高Wnt途径活性已与癌症关联，在所述癌症中有恶性结肠肿瘤。虽然不限于任 何具体操作理论，但认为恶性肿瘤细胞中的Wnt途径失调导致高Wnt途径活性，其依次又 引起恶性结肠细胞的细胞增殖，即结肠癌的传播。另一方面，例如在骨质疏松症的情况下， 异常低的途径活性也可能是有利的。在健康和疾病中的细胞分裂、功能和/或分化中起相 似作用的其他途径是细胞信号传导途径(例如ER、PR、AR、PPAR、GR、VitD、TGFbeta、Notch、 Hedgehog、FGF、NF K B、VEGF 和 PDGF)。
[0003] 获得基因组和蛋白组学数据的技术在临床背景下已变得容易获得。例如，通过微 阵列的测量常规用于评价基因表达水平、蛋白质水平、甲基化等等。自动化的基因测序允许 DNA和mRNA中的遗传变异/突变/异常甲基化模式的成本有效的鉴定。在基因测序期间的 mRNA水平的定量评价带来作为用于评价基因表达水平的临床工具的希望。
[0004] 治疗学家例如肿瘤科医生的主要挑战之一是对患者的预后作出有根据的猜测，因 为这种信息影响治疗选择。基于个别患者癌症组织样品的基因组学、转录组学和蛋白质组 学（以及其他"组学"）分析，提供了可以潜在地促成患者的预后评价的信息。然而，解释这 些复杂数据以提取有关临床信息已证明为挑战，在很大程度上仍是未解决的。患者预后可 以以几种方法以定量方式得到指示，如例如："复发时间"、或"转移时间"、或"存活时间"、或 "由于疾病或治疗的死亡风险"。
[0005] 发明概述 本发明提供了如本文公开的新的和改良的方法和仪器。
[0006] 依照本发明的主要方面，上述问题通过用于测定风险得分的具体方法得到解决， 所述风险得分指示临床事件将在某一时间段内发生的风险，所述方法即包括下述的方法： 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的细胞信号传导途 径的一种或多种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液中的两个或 更多个细胞信号传导途径的活性，和 测定指示临床事件将在某一时间段内发生的风险的风险得分，其中所述风险得分至少 部分基于推断活性的组合， 其中所述细胞信号传导途径包含Wnt途径、ER (雌激素受体）途径、HH (Hedgehog)途 径和/或AR (雄激素受体）途径， 其中所述细胞信号传导途径包含ER途径、Wnt途径和HH途径，并且其中所述风险得分 这样进行限定，使得临床事件将在某一时间段内发生的所示风险随着A#曾加而减少，并且 随着max (Z5fct、/^)增加而增加， 其中仏、尸_和仏分别指示ER途径、Wnt途径和HH途径的推断活性。
[0007] 受试者可以是人或动物，并且特别是医疗受试者。此外，"靶基因"可以是"直接靶 基因"和/或"间接靶基因"（如本文描述的)。
[0008] Wnt途径、ER途径、HH途径和AR途径优选定义为细胞信号传导途径，其最终导致 与途径相关的转录因子（TF)复合物的转录活性。优选地，这些分别由至少(6-连环蛋白/ TCF4、ERa二聚体、GLI家族成员和AR组成。
[0009] 受试者的组织和/或细胞和/或体液中的细胞信号传导途径活性的推断可以例如 尤其通过下述执行：（i)评估代表一组输入的细胞信号传导途径的概率模型(优选贝叶斯 网络）的至少一部分，所述一组输入包括至少在受试者的组织和/或细胞和/或体液中（例 如在组织载玻片或细胞上的染色)，或者在组织和/或细胞和/或体液的提取样品中，测量 的细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平，（ii)估计受试者的组织中的至少一 种转录因子（TF)元件的水平，所述至少一种TF元件控制细胞信号传导途径的一种或多种 靶基因的转录，所述估计至少部分基于关于至少一种TF元件的条件概率，以及在受试者的 提取样品中测量的细胞信号传导途径的一种或多种靶基因的表达水平，和（iii)基于在组 织样品和/或细胞样品和/或体液样品中估计的转录因子水平，推断细胞信号传导途径的 活性。这在公开的欧洲专利申请EP 2 549 399 Al("Assessment of Wnt pathway activity using probabilistic modeling of target gene expressions'，），且特别是公开的国际 专利申请 TO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression'，）中详细描述，所述专利的 内容随同整体引入。
[0010] 在示例性替代方案中，在受试者的组织和/或细胞和/或体液中的细胞信号传导 途径中的一种或多种的活性的推断可以例如尤其通过下述执行：（i)在受试者的组织和/ 或细胞和/或体液的提取样品中，测定转录因子（TF)元件的水平，该TF元件控制细胞信号 传导途径的一种或多种靶基因的转录，测定至少部分基于评估将细胞信号传导途径的一种 或多种基因的表达水平与TF元件的水平关联的数学模型，该模型至少部分基于一种或多 种靶基因的表达水平的一种或多种线性组合，和（ii)基于在受试者的组织和/或细胞和/ 或体液的提取样品中测定的TF元件水平，推断在受试者的组织和/或细胞和/或体液中 的细胞信号传导途径的活性。这在未公开的美国临时专利申请US 61/745839,相应的未公 开的国际专利申请 PCT/IB2013/061066 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination (s) of target gene expressions'，）中详细描述。
[0011] 优选地，细胞信号传导途径包含在癌症中起作用的至少一个细胞信号传导途径。
[0012] 特别优选的是其中细胞信号传导途径包含Wnt途径和/或HH途径的方法，并且其 中风险得分这样进行限定，使得临床事件将在某一时间段内发生的所示风险随着Wnt途径 的推断活性增加而增加，和/或随着HH途径的推断活性增加而增加。
[0013] 还特别优选的是其中细胞信号传导途径包含ER途径的方法，并且其中风险得分 这样进行限定，使得临床事件将在某一时间段内发生的所示风险随着ER途径的推断活性 增加而减少。
[0014] 进一步优选的是其中推断活性的组合包含下述表达的方法 -a?Per + ?maxiPWnt,PHH), 其中/^、/^和分别指示ER途径、Wnt途径和HH途径的推断活性，Q和々是非负 常数比例因子，并且临床事件将在某一时间段内发生的所示风险随着表达的值增加而单纯 增加。
[0015] 特别优选的是这样的方法，其中所述推断包括： 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的Wnt途径的一 种或多种，优选至少三种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液中的 Wnt 途径的活性，所述靶基因选自下述：KIAAl 199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGFl、S0X9、ASCL2、 IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6 和 FZD7， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的ER途径的一种 或多种，优选至少三种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液中的ER 途径的活性，所述靶基因选自下述：GREBI、PGR、XBPI、CA 12、SOD I、CTSD、IGFBP4、TFFI、SGK3、 NRIP1、CELSR2、WISP2 和 AP1B1， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的HH途径的一种 或多种，优选至少三种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液中的HH 途径的活性，所述靶基因选自下述：GLIl、PTCHl、PTCH2、IGFBP6、SPPl、CCND2、FST、FOXLl、 CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、FOXMl、GLI3、TCEA2、FYN和 CTSLl， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的AR途径的一种 或多种，优选至少三种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液中的 AR 途径的活性，所述靶基因选自下述：KLK2、PMEPAI、TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、 ￡让2、邯了2815、011〇?24、？？厶？2厶、灿1?1、1^161、〇?8314、1^^1、（；1^^认3、厶1?和￡八卩2。
[0016]进一步优选的是这样的方法，其中所述推断进一步基于： 在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的Wnt途径的至少一种靶 基因的表达水平，所述靶基因选自：NKD1、OAT、FAT1、LEF1、GLUL、REGIB、TCF7L2、C0L18A1、 BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKKl、HNFlA 和 LECT2， 和/或 在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的ER途径的至少一种靶基 因的表达水平，所述靶基因选自：RARA、MYC、DSCAM、EBAG9、C0X7A2L、ERBB2、PISD、KRT19、 HSPBl、TRIM25、PTMA、C0L18A1、CDH26、NDUFV3、PRDM15、ATP5J 和 ESRl， 和/或 在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的HH途径的至少一种靶基 因的表达水平，所述靶基因选自：BCL2、F0XA2、FOXFl、H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、 MYLK、NKX2. 2、NKX2. 8、PITRMl 和 T0M1， 和/或 在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的AR途径的至少一种靶基 因的表达水平，所述靶基因选自：APP、NTS、PLAU、CDKNIA、DRGI、FGF8、IGFI、PRKACB、PTPN1、 SGKl 和 TACC2。
[0017] 本发明的另一个方面涉及进一步包括下述的方法(如本文描述的）： 将受试者指定至与不同所示风险相关的多个风险组中的至少一个，所述风险指示临床 事件将在某一时间段内发生， 和/或 至少部分基于临床事件将在某一时间段内发生的所示风险，决定对于受试者推荐的治 疗。
[0018] 本发明还涉及包括下述的方法(如本文描述的）： 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的Wnt途径的一组 靶基因的两种、三种或更多种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液 中的Wnt途径的活性， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的ER途径的一组 靶基因的两种、三种或更多种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液 中的ER途径的活性， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的HH途径的一组 靶基因的两种、三种或更多种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液 中的HH途径的活性， 和/或 至少基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液的提取样品中测量的AR途径的一组 靶基因的两种、三种或更多种靶基因的表达水平，推断受试者的组织和/或细胞和/或体液 中的AR途径的活性。
[0019] 优选地， Wnt途径的靶基因的组包含选自下述的至少九种，优选全部靶基因：KIAA1199、AXIN2、 RNF43、TBX3、TDGF1、S0X9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6 和 FZD7， 和/或 ER途径的靶基因的组包含选自下述的至少九种，优选全部靶基因：GREB1、PGR、XBP1、 CA12、SODl、CTSD、IGFBP4、TFFl、SGK3、NRIPl、CELSR2、WISP2 和 APlBl， 和/或 HH途径的靶基因的组包含选自下述的至少九种，优选全部靶基因：GLI1、PTCH1、 PTCH2、IGFBP6、SPPl、CCND2、FST、FOXLl、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、 FOXMl、GLI3、TCEA2、FYN 和 CTSLl， 和/或 AR途径的靶基因的组包含选自下述的至少九种，优选全部靶基因：KLK2、PMEPA1、 TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、ELL2、UGT2B15、DHCR24、PPAP2A、NDRGl、LRIGl、
[0020] 特别优选的是这样的方法，其中 Wnt途径的靶基因的组进一步包括选自下述的至少一种靶基因：NKD1、OAT、FAT1、 LEFl、GLUL、REGlB、TCF7L2、C0L18A1、BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKKl、HNFlA 和 LECT2、 和/或 ER途径的靶基因的组进一步包括选自下述的至少一种靶基因：RARA、MYC、DSCAM、 EBAG9、C0X7A2L、ERBB2、PISD、KRT19、HSPBI、TR頂25、PTMA、COL18AI、CDH26、NDUFV3、PRDMl5、 ATP5J 和 ESR1， 和/或 HH途径的靶基因的组进一步包括选自下述的至少一种靶基因：BCL2、F0XA2、F0XF1、 H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、MYLK、NKX2. 2、NKX2. 8、PITRMl 和 T0M1， 和/或 AR途径的靶基因的组进一步包括选自下述的至少一种靶基因：APP、NTS、PLAU、 CDKN1A、DRG1、FGF8、IGF1、PRKACB、PTPN1、SGKl 和 TACC2。
[0021] 待依照本发明使用的样品可以是优选经由活组织检查操作或其他样品提取操作， 例如得自癌症病变，或怀疑癌症的病变，或转移性肿瘤，或其中存在被癌细胞污染的流体的 体腔(例如胸膜腔或腹腔或者膀胱腔)，或含有癌细胞的其他体液等等的样品。样品由其提 取的细胞还可以是来自血液系统恶性肿瘤(例如白血病或淋巴瘤)的肿瘤细胞。在一些情况 下，细胞样品还可以是循环肿瘤细胞，即已进入血流且可以使用合适的分离技术(例如血浆 分离置换法（apheresis)或常规静脉抽血)提取的肿瘤细胞。除血液之外，样品由其提取的 体液可以是尿、胃肠内容物或渗出液。如本文使用的，术语"提取的样品"还涵盖这样的情 况，其中受试者的组织和/或细胞和/或体液已取自受试者并且例如已置于显微镜载玻片 上，并且其中为了执行请求保护的方法，例如借助于激光捕获显微切割（LCM)，或通过从载 玻片上刮取目的细胞来提取该样品的一部分，或通过荧光激活细胞分选技术。
[0022] 进一步优选的是这样的方法，其进一步包括组合风险得分和/或推断活性中的至 少一种与得自一种或多种另外的预后测试的一种或多种另外的风险得分，以获得组合的风 险得分，其中所述组合的风险得分指示临床事件将在某一时间段内发生的风险。一种或 多种另外的预后测试可以特别包含Oncotype DX?乳腺癌测试、