该替代方法基于优 势比的算法(例如基础e)，并且因此称为"优势比"权重。基于探针/基因水平高于和低于 相应阈值的阳性和阴性训练样品数目，所述阈值例如所有训练样品的中值，计算关于每种 探针或基因的优势比(等式3)。可以加入假计数，以避免除以零(等式4)。进一步的精化是 通过下述以略微更随机的方式计数高于/低于阈值的样品：假定探针/基因水平例如以某 一指定的标准差(例如在2-log尺度上0. 25)在其观察值周围正态分布，并且计数高于和低 于阈值的概率质量(等式5)。
[0097]可替代地，可以采用本领域已知的优化算法例如回归，以测定本文描述的(假）线 性模型的权重和阈值。
[0098]必须特别注意对于(假）线性模型测定的参数概括良好的方式。可替代地，可以使 用本领域已知的其他机器学习方法例如贝叶斯网络，以能够通过在训练操作期间取得专门 测量来相当良好地概括。
[0099]优选地，Wnt、ER、HH和AR途径的（假）线性模型的训练使用在Gene Expression Omnibus (在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/处可获取)上可获得的公开数据来完成。 模型使用此类公开数据示例性训练。
[0100]请注意就TO 2013/011479 A2 和 US 61/745839,相应的 PCT/IB2013/061066 而言， 在所附权利要求中限定的ER靶基因的排名次序略微改变，因为添加新的文献证据。以与US 61/745839,相应的PCT/IB2013/061066的实施例3中所述相似的方法，将ER靶基因选择且 排名。通过组合文献证据得分和每种基因区分Affymetrix模型内的活跃和失活途径的个 别能力，将基因排名。当用MCF7细胞系样品的训练集训练模型，所述训练集耗尽雌激素且 随后保持耗尽或暴露于I nM雌激素24小时（GSE35428)，并且用训练集和两个其他训练集 测试模型，在所述两个其他训练集中MCF7细胞耗尽雌激素且随后保持耗尽或暴露于10 nM 或25 nM雌激素(分别为GSE11352和GSE8597)时，这种排名基于对于每种基因获得的加权 假阳性和假阴性率的线性组合。
[0101](注意到加权假阳性和假阴性的组合(代替优势比）用于解释各个集合中使用的不 同实验条件。不同权重根据本发明人的置信度进行设置：假阳性(阴性）是模型而不是已对 样品实施的不同实验条件的结果。例如，在所有实验中，在暴露于雌激素或进一步耗尽另外 24小时之前，MCF7细胞系样品首先耗尽雌激素一段时间。更短的耗尽时间可以促使尽管雌 激素耗尽，途径仍是活跃的，在这种情况下，假阳性具有比测试和训练样品两者均耗尽相同 时间量时更少的权重。） 实施例2 :测定风险得分 一般而言，可以设计许多不同公式用于测定风险得分，所述风险得分指示临床事件将 在某一时间段内发生的风险，并且至少部分基于在受试者的组织和/或细胞和/或体液中 的两个或更多个细胞信号传导途径的推断活性组合，即：
其中#/?是风险得分(术语" #/5"在本文中用作"多途径得分"的缩写，以便指示风险 得分受两个或更多个细胞信号传导途径的推断活性影响)，A是细胞信号传导途径i的活性 得分，#是在考虑中的细胞信号传导途径的总数目，并且X是可能进入等式内的可能的进一 步因子或参数的占位符。此类公式可以更具体地是给定变量中的一定程度的多项式，或变 量的线性组合。此类多项式中的加权系数和幂可以基于专家知识进行设置，但通常具有已 知基本事实例如存活数据的训练数据集用于获得关于等式（6)的加权系数和幂的估计值。 推断活性可以使用等式（6)进行组合，并且随后生成#/5。接下来，这样优化评分函数的加 权系数和幂，使得高#/?与直至临床事件出现的更长时间段关联，并且反之亦然。优化评分 函数与复发数据的关联可以使用许多分析技术来完成，例如Cox比例风险检验(如本文示 例性使用的)、时序检验、与标准优化技术例如梯度下降或手动适应结合的卡普兰-迈耶估 计量。
[0102] 在该实施例中，临床事件是癌症，特别是乳腺癌，并且考虑Wnt途径、ER (雌激素受 体）途径、HH (Hedgehog)途径和AR (雄激素受体）途径的推断活性，如公开的国际专利申 请 WO 2013/011479 A2 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression'，），或未公开的美国临时专利申 请 US 61/745839,相应的未公开的国际专利申请 PCT/IB2013/061066 ("Assessment of cellular signaling pathway activity using linear combination (s)of target gene expressions"）中详细讨论的。
[0103] 本文示例性使用的公式考虑到Wnt途径、ER途径和HH途径的活性。它基于衍生 自癌症生物学研究的本发明人的观察，以及在可公开获得的数据集中发现的存活以及Wnt、 ER和HH途径活性之间的关联。早期发育途径如Wnt和Hedgehog被认为在通过癌细胞引起 的转移中起作用，所述癌细胞恢复为更干细胞样表型，称为癌干细胞。事实上，本发明人认 为关于早期发育途径例如Wnt途径在癌症转移中起作用允许转移癌细胞在另一个器官或 组织中的种植位置中开始分裂，可获得足够指示。转移与不良预后相关且代表癌症复发形 式，因此在癌细胞中的早期发育途径例如Wnt和HH途径的活性由本发明人预期为预示不良 预后，而ER途径的活性看起来与乳腺癌患者中的不良结果关联。Wnt和Hedgehog途径在癌 症进展和转移中的假定作用基于临床前研究，并且在受试者中未得到显示，因为无法获得 用于测量其活性的方法。
[0104] 根据生物学研究的这些本发明人观察，以及Wnt和HH活性可以在癌症复发中起作 用和ER活性看起来与良好临床结果联系的临床关联，在本文中组合在下述示例性公式中
其中仏、/^郝/^分别指示ER途径、Wnt途径和HH途径的推断活性(例如在0至1的 范围内），并且〇和0是非负优选正常数比例因子。在该实施例中，〇和0示例性选择为 等于1，并且已使用处于其活性状态的Wnt途径、ER途径和HH途径的概率，如通过公开的国 际专利申请WO 2013/011479 A2("Assessment of cellular signaling pathway activity using probabilistic modeling of target gene expression'，）中详细描述的方法推断 的。使用ER、Wnt和HH途径的本文的贝叶斯网络模型包含A)目的转录因子水平的顶部水 平结点，B)代表目的靶基因的存在的结点水平(分别为WO 2013/011479 A2中的表2、表1 和表3)，和C)代表与目的靶基因相关的探针组的结点水平(分别为WO 2013/011479 A2中 的表2、表1和表3)。存在或不存在的TF元件的先前概率设为0.5。如WO 2013/011479 A2中所述，水平A和B之间的条件概率如下仔细地精心挑选：（i)TF不存在/靶基因向下： 0. 95，（ii)TF不存在/靶基因向上：0. 05,（iii)TF存在/靶基因向下：0. 30,和（iv)TF 存在/靶基因向上：〇. 70,其中水平B和C之间的条件概率分别在来自GSE8597、GSE8671和 GSE7553的数据上进行训练。
[0105] 作为训练数据，GSE8597已用于ER途径，GSE8671已用于Wnt途径，并且GSE7553 已用于HH途径。在推断中已掺入的靶基因是用于ER途径的GREBI、PGR、XBPI、CAl2、SOD 1、 CTSD、IGFBP4、TFFl、SGK3、NRIPl、CELSR2、WISP2、APlBl、RARA、MYC、DSCAM、EBAG9、C0X7A2L、 ERBB2、PISD、KRT19、HSPBI、TR頂25、PTMA、COL18AI、CDH26、NDUFV3、PRDMl5、ATP5J、ESRl，用 于 Wnt 途径的 KIAAl 199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGFl、S0X9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、 CCNDl、DEFA6、FZD7、NKDl、OAT、FATl、LEFl、GLUL、REGIB、TCF7L2、C0L18A1、BMP7、SLC1A2、 ADRA2C、PPARG、DKKl、HNF1A、LECT2,以及用于 HH 途径的 GLII、PTCHl、PTCH2、IGFBP6、SPPl、 CCND2、FST、F0XL1、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、F0XM1、GLI3、TCEA2、FYN、 CTSL1、BCL2、F0XA2、F0XF1、H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、MYLK、NKX2. 2、NKX2. 8、PITRM1 和 TOMl〇
[0106] 所得到的#/?范围为_1(其表明临床事件(此处为局部或远处的癌症特别是乳腺 癌）在某一时间段内复发的低风险）至关于高风险复发患者的+1。
[0107] 请注意虽然在下文中，使用根据等式（7)计算的#/?;但基于Wnt、ER和HH途径的 推断活性，计算风险得分（#/5)的另一种合适方法由下述示例性公式提供：
其中仏、/^郝/^分别指示ER途径、Wnt途径和HH途径的推断活性(例如在0至1的 范围内），并且〇、0和r是非负常数比例因子。
[0108] 使本文示例性使用的此类预后价值量化的两种方法是Cox比例风险回归模型，以 及与时序检验结合的卡普兰-迈耶曲线： 第一种方法将风险模型与存活数据伴随一种或多种协变量拟合。总之，此类风险模型 解释了基于协变量的(数）值，在群体内的存活(临床事件）中的变动。由于拟合，每个包括 的协变量将指定危害比（HR)，其基于协变量的值定量临床事件的相关风险，例如HR二对应 于伴随协变量值增加一的关于患者的目的临床事件两倍更高的风险。详细地，HR值为一意 指这种协变量对存活没有影响，而对于HR〈 1，协变量数目中的增加表明更低的风险，并且 协变量数目中的减少表明更高的风险，并且对于HR > 1，协变量数目中的增加表明更高的 风险，并且协变量数目中的减少表明更低的风险。连同危害比一起，报道了 95%置信区间和 P值（即，危害比显著小于或大于一的单侧概率)。所有协变量在零和一之间定标，以作出简 单的危害比的直接比较。
[0109] 后面一种方法涉及标绘卡普兰-迈耶曲线，其代表根据时间的临床事件存活概 率。例如，通过基于示例性预后测试，对于群体中的不同风险组标绘卡普兰-迈耶曲线，可 以显现示例性临床事件风险的分开的质量。这种质量可以进一步借助于时序检验进行量 化，所述时序检验计算两个存活函数相等的概率（P值)。
[0110] 为了根据风险将患者分层，示例性使用下述算法：具有#/?小于_ 0. 1的患者与高 ER途径活性概率关联，并且因此指定为具有低复发风险，而#/?大于+0. 1与高风险Wnt和 /或HH途径的高活性相关，并且因此与高复发风险关联。具有在-0.1和+0.1之间的#/5 的患者分类为具有发展复发的中度风险，因为这个组包括具有活跃的低风险途径例如ER 途径，以及高风险信号传导途径例如Wnt或HH的活化的患者，或其中途径无一推断为驱动 肿瘤生长的患者。阈值-0. 1和+0. 1基于在多个数据集中所得到的#/?得分分布的分析， 所述数据集包括1294个多样化乳腺癌患者，如Gene Expression Omnibus(在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/ 处可获得的 GSE6532、GSE9195、GSE20685、GSE20685 和 GSE21653， 2013 年 2 月 13 日最后一次访问）和 ArrayExpress (E-MTAB-365, http://www. ebi. ac. uk/ arrayexpress/experiments/，2013年2月13日最后一次访问）中报道的，如图1中可见的。
[0111] 作为基准，使用分开的途径活性和来自Genomic Health的乳腺癌Oncotype DX? 测试，其显示为良好的复发预测物，并且与关于乳腺癌的其他基于基因表达的预测物一致。 Oncotype DX?测试返回0至100的风险或复发得分（必')，其基于对于基因实验对象组测量 的表达水平组合进行计算。必就ER阳性、HER2阴性（蛋白质染色或FISH)、淋巴结阴性乳 腺癌患者中的10年存活而言进行优化(参见Paik，S.，等人："A multi-gene assay to predict recurrence of Tamoxifen-treated, node-negative breast cancer, '， The New England Journal of Medicine，351 (27)，（2004)，第 2817 - 2826 页；Fan，C.，等人： "Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer, '， The New ￡即1&]1(1]〇111'仙1〇€]\16(1;[(3；[116,355(6)，（2006)，第 560 - 569 页）。遵循通过？&11等人（参 见Fan，C.，等人（2006))报道的操作，使用在所述数据集中报道的微阵列表达数据计算#5; 并且随后根据Oncotype DX?风险分层算法，将患者分成低风险、中度风险和高风险患者。
[0112] 结果 (i ) Erasmus 数据 来自 Gene Expression Omnibus (在 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/处可获得， 2013年2月13日最后一次访问）的GSE12276中的所有204个患者经历复发（中值复发时 间：21个月，范围：0 - 115个月），这使得其成为研究途径活性得分及其衍生的#/?就复 发风险而言的预后价值的良好数据集，以察看它们是否可以将早期复发病例与晚期病例分 开。
[0113] 单变量Cox比例风险回归模型使用Wnt途径、ER途径、HH途径和AR途径，以及关 于#5和#/?的标准化值（即0至1之间的值）进行拟合，参见下表12。单变量分析指示#S 和#/?两者均具有显著大于1的危害比，而具有显著小于1的危害比。包括必与 #/?的组合的多变量分析导致两种显著预测物（p〈 0.05)。然而，#尸5和的组合导致关 于预测物之一的显著性丧失（#/没p > 0.05)，这通过也是多途径得分的元素的事实加 以解释。因此，使用的多变量分析在逻辑上也失败。
[0114] 表12. GSE12276中的所有患者的Cox比例危害比。
[0115] 总之，单变量分析显示就复发而言，来自Genomic Health的Oncotype DX?复发得 分（^幻具有比基于途径的预测物更强的预测力，这并非出乎意料的，因为^ 特异性优化以预测复发，而/^、^旨在预测途径活性。然而，仏以及由其与/^郝 组合衍生的#/?也是关于复发的很强的显著预测物。另外，组合必与#/?导致改 善的风险分层，胜过分开的预测物(不显著，P 0.14)。另外，这还暗示Oncotype DX?复 发得分（必')和多途径得分（#/5)是互补的复发预测物，并且两者均视为肿瘤生长潜在的不 同机制。
[0116] 考虑到来自相同数据集的仅71个患者对于Oncotype DX?乳腺癌测试符