石龟活性肽精制法及在预防肝硬化、抗疲劳中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物保健食品技术领域，具体说是石龟活性肽精制法及在预防肝硬 化、抗疲劳中的应用。
【背景技术】
[0002] 当今社会，生活节奏快，竞争激烈，工作、学习和生活压力大，不少人忙于工作，透 支健康，进食不规律，饮食无节制，引起肝、肾系统的紊乱，直接或间接损伤肝肾，免疫力降 低，抗病能力下降，在我国，约有15 %的人是健康的，15 %的人处于非健康，70 %的人呈"亚 健康"状态。目前"亚健康"人群的规模及严重程度已不容乐观，研究开发出保护肝肾组织、 预防肝硬化，抗疲劳，增强免疫力，提高人们的生活质量和身体素质的保健品已是非常迫 切。
[0003] 石龟，即广西拟水龟，又称石金钱龟、越南石龟、广西水龟、黄喉水龟，作为药用首 载于汉代《神农本草经》，列为上品，此后本草多有记载，其中《本草求真》言"专入肾，兼入 心，甘咸，微寒"，《本草纲目》记载道"（龟）能通任脉，故取其甲以补心、补肾、去瘀血，止血 痢，续筋骨，治劳倦，消痈肿"。自古以来，我国就有食龟强身健体的保健功效，现代医学研究 表明，龟含有丰富的人体必需氨基酸、蛋白质、角质、骨胶原、Ca、P、K及多种维生素、血糖、月旨 肪酸等营养成分，人体易吸收，加上龟耐饥、耐渴、耐寒、寿命长的生活习性，构成了其机体 多种长寿细胞因子，具有滋阴潜阳，益肾强骨，固经止血，补心安神，可用于肾阴不足，阴虚 偏亢，盗汗，遗精等，尤其是针对肝纤维化，抗疲劳等表现出较好的保健功效，还有研究发现 石龟活性肽可促进癌症患者在放化疗后体内白细胞生长，恢复身体健康，达到防癌功效。
[0004] 钦州，地处亚热带沿海区，气候适宜，由于地理自然条件得天独厚，钦州石金钱龟 更接近自然生态产品，品质优异，已成为中国地理标志产品，以其独有的营养保健、经济价 值成为名优养殖的后起之秀，目前石龟养殖户已过万，年产值超过3. 5亿，然而，尽管货源 充足，但更多还停留于单一养殖销售模式，已上市的产品种类较少如：鲜活速冻品、罐装食 品，且往往工艺粗糙，口感差，缺乏市场竞争力，精深加工仍处于空白状态。如何从石龟中 提取、分离纯化出活性肽仍是研究的一大难点，传统的炮制法有效成分煎出需较长时间，能 耗大，一般的酸提取法部分氨基酸受破坏，产品得率低，碱水提取法提取出的含有羟基和巯 基的氨基酸易发生消旋作用，肽类失活，且肽类的分离纯化是一项系统工程，一般的沉降过 滤、离心分离、溶剂萃取是很难达到良好分离效果，故本发明在前期大量实验基础上研制出 一种石龟深加工方法，提取率高，分离纯化效果好，活性高，旨在充分利用钦州地方资源优 势，对石龟营养、保健价值深入系统研究，形成科研、生产、深加工、销售为一体的完整体系， 研制出的石龟活性肽具有较好的预防肝硬化，抗疲劳，增强免疫力保健功效。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单安全、易操作、产品纯度高 的石龟活性肽精制法，还提供了其在预防肝硬化、抗疲劳保健应用，旨在以充分利用地方石 龟资源，开发出更多应用前景广阔的深加工保健品。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供了石龟活性肽精制法，包括如下步骤：
[0007] 1)原料预处理：将石龟处死，去头，剔除内脏，洗涤3-4次，粉碎，调pH 2-3,10°C以 下浸泡24h，待膨胀均匀后取出，用水反复清洗2-3次至无酸味，沥干，加水8-10倍打浆，至 匀浆液，加水补足失重；
[0008] 2)酶解：向步骤1)得到的匀浆液中加入1% (w/w)柠檬酸作为酶解法提取介质， 调节PH 2-4,加入0.5-2% (w/w)的胃蛋白酶，4°C下酶解5-7h，每小时搅拌10-15min，加 热，灭酶活，得石龟酶解液；
[0009] 3)多级膜分离纯化：
[0010] ①微滤：取步骤2)得到的石龟酶解液，加水稀释至质量分数为10%，用0. 3 ym膜 微滤，操作压力为〇.2MPa;
[0011] ②一级超滤：将步骤①得到的滤液通过20kD超滤膜超滤，操作压力0? 2-0. 25MPa， 超滤2_3次；
[0012] ③二级超滤：将步骤②所得滤液再采用10kD超滤膜在0. 8MPa操作压力下超滤2 次，得到透过液，高压灭菌，减压浓缩干燥；
[0013] ④定期膜清洗：反应一段时间后，超滤膜有凝胶层，膜通量会降低，进行膜清洗，先 用水冲洗约15min，至透过液无色无味，加0. 5% (w/w)氢氧化钠反复冲洗15min，水洗至滤 过液为中性；
[0014] 4)灭菌、干燥，得石龟活性肽粉末。
[0015] 本发明所用水优选纯净水。
[0016] 步骤1)所述的醋酸的添加量优选1:20 (w/v)。
[0017] 步骤2)所述的搅拌，优选采用磁力搅拌机搅拌。
[0018] 步骤4)所述的灭菌、干燥，优选采用喷雾干燥，进风温度120_150°C，出风温度 70-90。。。
[0019] 本发明还涉及采用上述精制法得到的石龟活性肽，以及其在预防肝硬化、抗疲劳 中的应用，还可根据实际需要，添加纯净水，香精适量，采用现有的制剂技术和工艺方法，与 常用辅料制成口服制剂，包括口服液，颗粒剂、片剂、胶囊剂等。
[0020] 和现有技术相比，本发明的优点在于：
[0021] 1、现有技术中，一般的酸提取法部分氨基酸受破坏，产品得率低，碱水提取法提取 出的含有羟基和巯基的氨基酸易发生消旋作用等缺点。本发明加入1 %柠檬酸作为酶解提 取介质，调节PH2-4,提供酸性反应环境，使原料溶胀，结构更加蓬松，利于胃蛋白酶渗透，且 在此环境下是胃蛋白酶处于最适宜的PH，酶活性提高，活性肽提取率在25%以上，克服了 传统炮制法在提取过程易出现沉淀，耗时耗能的缺点。
[0022] 2、本发明考虑到了石龟酶解液含有大量的蛋白类物质，操作一定时间后超滤膜表 面会吸附一定量蛋白质类物质，形成凝胶层，使膜通量下降，影响分离效果，公开了一种操 作简便，快速，可行的膜清理方法，在反应一段时间后，采用〇. 5%氢氧化钠循环洗膜清洗， 当测定滤过液为中性时即可，此步骤可保证系统维持一个较为理想的膜通透量。
[0023] 3、本发明在进行多级超滤前经过0.3ym的微滤膜预处理，防止大分子悬浮杂质 及蛋白污染超滤膜，再通过20kD超滤膜超滤去除大分子杂质蛋白，得到滤液再经过10kD 超滤膜去除一些无机盐和小分子杂质，最终得到石龟活性肽纯度在75%以上，分子量小于 10KD，可以完整形式进入机体循环系统，与正常人体内生理产物接近，利于机体吸收，而一 般的离心、沉降过滤法分子量分布不均一，难吸收，此微滤、多级膜分离过程中同时完成了 脱盐，脱苦，所制得的石龟活性肽颜色变淡，口感好。
[0024] 4、本发明采用微滤及多级膜分离酶解液，实现了酶解产物分子量分布的有效控 制，分子量小于10KD，成分趋于均一，性质稳定，并与普通离心分离法所制得酶解液进行药 效学比较，结果发现对于CC1 4所致大鼠肝损伤模型，普通离心分离法组大鼠的肝脏显淡黄 色，有轻微的肿胀，表明呈颗粒结节状，而多级膜分离组，大鼠肝脏介于红褐色和淡黄色之 间，未发现明显的颗粒结节物，这是因为普通分离所得的活性肽中寡肽分子量分布广，不易 吸收，而多级膜分离活性肽中寡肽分子量集中，小分子肽含量高，活性强，使肝纤维化发生 逆转，在保护肝组织，预防肝硬化作用更明显。
【具体实施方式】
[0025] 下面以实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0026] 实施例1
[0027] 石龟活性肽精制法，包括如下步骤：
[0028] 1)原料预处理：将石龟处死，去头，剔除内脏，清水洗涤3次，初粉碎，加PH 2. 5左 右的醋酸（1:20W/V)，5°C浸泡24h，待膨胀均匀后取出，加水反复清洗2次至无酸味，沥干， 加水8倍打浆，至匀浆液，加水补足失重，备用；
[0029] 2)酶解：在匀浆液中加入1 %柠檬酸作为酶解法提取介质调节PH至3,加入1 %的 胃蛋白酶，4°C下酶解5h，每lh采用磁力搅拌机搅拌15min，加热，灭酶活，得石龟酶解液；
[0030] 3)多级膜分离纯化：
[0031] ①微滤：取石龟酶解液，加水稀释至质量分数约为10%，用0. 3 ym膜微滤，操作压 力为0. 2MPa;待微滤至加入量的80 %时，向截留液中加入适量水，搅拌，继续微滤，待微滤 液收集至体积等于药液加入量时，停止微滤，得微滤液备用；
[0032] ②一级超滤：滤液通过20kD超滤膜超滤，操作压力0?2MPa，超滤2次；
[0033] ③二级超滤：一级超滤所得滤液再采用10kD超滤膜在0. 8MPa操作压力下超滤2 次，得到透过液；
[0034] ④定期膜清洗：反应一段时间后，若发现超滤膜有凝胶层，膜通量降低时，需进行 膜清洗，先用水冲洗约15min，至透过液无色无味，用0. 5%氢氧化钠反复冲洗15min，水洗 至滤过液为中性；
[0035] 4)灭菌，干燥：灭菌，采用喷雾干燥法干燥，进风温度120°C，出风温度90°C，得石 龟活性肽粉末。
[0036] 实施例2
[0037] 石龟活性肽精制法，包括如下步骤：
[0038] 1)原料预处理：将石龟处死，去头，剔除内脏，清水洗涤4次，初粉碎，加PH 2.5左 右的醋酸（1:20W/V)，10°C浸泡24h，待膨胀均匀后取出，加水反复清洗3次至无酸味，沥干， 加水9倍打浆，至匀浆液，加水补足失重，备用；
[0039]2)酶解：在匀浆液中加入1%柠檬酸作为酶解法提取介质调节PH至3,加入2%的 胃蛋白酶，4°C下酶解7h，每lh采用磁力搅拌机搅拌15min，加热，灭酶活，得石龟酶解液