一种svf的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SVF的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前，脂肪组织因其在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用已被认为是一个内分泌器官。此外，它还是具有多向分化潜能的多功能细胞的来源之一，而这种多功能细胞就存在于脂肪组织的血管基质部分中。脂肪组织中的血管基质部分(SVF)是脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到的。正因为SVF易于从脂肪组织中提取并含有丰富的、可塑性极强的脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells, ASC),所以对SVF的提取和制备是有必要进行研究的。间充质干细胞(如骨髓基质干细胞、脂肪组织来源干细胞)在临床多个领域都有巨大的潜在应用空间，国内外均有大量相关的基础及临床实验研究，目前干细胞治疗在整形外科、心脏科、血管外科、烧伤科、消化科、血液科、风湿免疫科等领域都有相关临床应用开展。
[0003]但是，对于SVF的提取和制备就现有技术而言，还存在以下的不足:
[0004]1.胶原酶用量较多且最后的残留量也较多，大大影响了 SVF的纯度；
[0005]2.制备得到的SVF细胞活性和增殖活性较低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种SVF的制备方法，该方法制得的SVF的细胞活性和增殖活性较高。
[0007]为实现上述目的，本发明的技术方案实施如下:
[0008]本发明的一种SVF的制备方法，包括以下具体步骤:
[0009]步骤1:将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将所述脂肪装于无菌离心管中，并加入胶原酶溶液和生理盐水，所述胶原酶溶液与所述脂肪的体积比为1:10 ;
[0010]步骤2:将所述无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37°C温度下消化30-90分钟，所述恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上；
[0011]步骤3:将所述无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300-400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入1ml生理盐水重悬，并通过100 μ m单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；
[0012]步骤4:将步骤3中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600-700g，每次3-5分钟，即得所述SVF。
[0013]上述的一种SVF的制备方法中，所述步骤I的详细操作如下:将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将1ml所述脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入Iml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至所述无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。
[0014]上述的一种SVF的制备方法中，所述胶原酶溶液的制备方法如下:在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，所述胶原酶溶液的浓度为lmg/ml。
[0015]本发明方法胶原酶用量较低，制备得到的SVF中胶原酶含量非常低，基本可以忽略不计，同时本发明方法制备得到的SVF在细胞活性和增殖活性上也较常规方法制得的SVF要更高。
【附图说明】
[0016]图1是本发明制得的SVF与其他方法得到的SVF的生长曲线图；
[0017]图2是本发明制得的SVF的细胞增殖情况；
[0018]图3是采用其他方法制得的SVF的细胞增殖情况。
【具体实施方式】
[0019]下面将结合实施例，对本发明作进一步说明。
[0020]实施例
[0021]本实施例SVF的制备方法，包括以下具体步骤:
[0022]步骤1:制备胶原酶溶液:在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，该胶原酶溶液的浓度为lmg/ml ;
[0023]步骤2:将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将1ml脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入Iml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止；
[0024]步骤3:将无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37°C温度下消化30-90分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上；
[0025]步骤4:将无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300_400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入1ml生理盐水重悬，并通过100 μ m单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；
[0026]步骤5:将步骤4中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600_700g，每次3-5分钟，即得SVF0
[0027]本发明方法制得的SVF与现有方法制得的SVF试验对比如下:
[0028]1.胶原酶残留的检测:
[0029]文献中常用的胶原酶的消化脂肪的消化浓度是0.075%。
[0030]本发明中胶原酶消化浓度为0.01 %，低于常用胶原酶的消化浓度，在反复2?3次清洗后，在获得的SVF中胶原酶残留量非常低，可忽略不计。
[0031]2.胶原酶用量的比较:
[0032]20ml脂肪，本发明方法采用2mg胶原酶，而常规方法采用24mg胶原酶，最后制得的SVF 的量无明显差异，分别为:1.11±0.13X 16 (η = 5)和 1.09±0.21 X 16 (η = 5)ρ>0.05。
[0033]3.采用CCK8法测试不同方法制备的SVF的细胞活性，结果如图1所示，图1中A为本发明方法制得的SVF，B为现有方法制得的SVF，由此可见，本发明方法制得的SVF的细胞活性更高。
[0034]4.不同方法制备的SVFPO培养6天(40 X )，其中图2是本发明方法制得的SVF，图3是现有方法制得的SVF，通过比较可以看到本发明方法制得的SVF的增殖活性更强。
[0035]以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。
【主权项】
1.一种SVF的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤: 步骤1:将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将所述脂肪装于无菌离心管中，并加入胶原酶溶液和生理盐水，所述胶原酶溶液与所述脂肪的体积比为1:10 ; 步骤2:将所述无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37°C温度下消化30-90分钟，所述恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上； 步骤3:将所述无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300-400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入1ml生理盐水重悬，并通过100 μ m单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用； 步骤4:将步骤3中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600-700g，每次3-5分钟，即得所述SVF02.如权利要求1所述的一种SVF的制备方法，其特征在于，所述步骤I的详细操作如下:将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将1ml所述脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入Iml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至所述无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。3.如权利要求1或2所述的一种SVF的制备方法，其特征在于，所述胶原酶溶液的制备方法如下:在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，所述胶原酶溶液的浓度为lmg/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种SVF的制备方法，在抽吸的人体脂肪加入胶原酶溶液和生理盐水，在37℃温度下消化30-90分钟，离心去上清，在下层中加入10ml生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，留滤渣，并离心洗涤两次即得所述SVF。本发明方法胶原酶用量较低，制备得到的SVF中胶原酶含量非常低，基本可以忽略不计，同时本发明方法制备得到的SVF在细胞活性和增殖活性上也较常规方法制得的SVF要更高。
【IPC分类】C12P21/06, C12N5/077
【公开号】CN105132500
【申请号】CN201510548691
【发明人】李青峰, 李华, 成琴芳
【申请人】李青峰
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月31日