上述方法 再进样一次，产品馏分按实施例2中的HPLC条件检测，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥，即 得95%以上纯度的2号峰化合物（推测为表儿茶素巯乙胺基取代物）。
[0099] 本实施例中制备得到的3个95%以上纯度化合物的HPLC图见图2A、2B、2C。
[0100] 实施例5 :3个95%以h纯度化合物1H-NMR谱的测宙
[0101] 所用样品为前面实施例3制得的1号峰化合物、3号峰化合物以及实施例4制得的 2号峰化合物或者实施例3制得的2号峰C18常压柱色谱分离样品1 (纯度95%以上）。
[0102] 精密称定各待测化合物3mg，以DMS0-d6溶解后，进行测定。
[0103]1 号峰化合物"H-NMR 谱（400MHz，DMS0-d6) S :2. 93 ~2. 62 (4H, m, -CH2-CH2-)， S :3.86 ~3.82(lH，m，4-H)，S :4.03(lH，s，3-H)，S :4.64(lH，d，J = 9.64Hz，2-H)，S :5.47(lH，s，6-H)，S :5.78(lH，s，8-H)，S :6.65 ~6.54(3H，m，J =8. 08Hz, 2 ' -H, 5 ' -H, 6 ' _H)。结合文献数据（J. L. Torres and R. Bobet, New Flavanol Derivatives from Grape(Vitis vinifera)Byproducts. Antioxidant Aminoethylthi〇-Flavan-3-〇l Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols,J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4627-4634)，鉴定化合物 1 为 40-(2-氨基乙硫基）儿茶素，其结构见前面的化合物1。
[0104]2 号峰化合物"H-NMR 谱（400MHz，DMS0-d6) S :3. 09 ~2. 72 (4H, m, -CH2-CH2-)， 8 ：3. 82(2H, ss, 3-H, 4-H) , 8 ：5. 02 (1H, s, 2-H) , 8 ：5. 68(1H, d, J = 2. 24Hz, 6-H), S :5.89(lH，d，J = 2.24Hz，8-H)，S :6.88 ~6.65(2H，m，5 ， -H，6 ， -H)，S : 6. 91 (lH，s, 2' _H)。结合文献数据（J.L. Torres and R.Bobet, New Flavanol Derivatives from Grape (Vitis vinifera)Byproducts. Antioxidant Aminoethylthi〇-Flavan-3-〇l Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols, J. Agric. Food Chem. 2001，49, 4627-4634)，鉴定化合物2为4f3-(2-氨基乙硫基）表儿茶素， 其结构见前面的化合物2。
[0105] 3 号峰化合物"H-NMR 谱（400MHz，DMS0-d6) S :3. 08 ~2. 86 (4H, m, -CH2-CH2-)， 8 ：3. 93 (1H, s, 4-H) , 8 ：5.07(1H, d, J = 4. 72Hz, 3-H) , 8 ： 5. 29 (1H, s, 2-H), 8 ：5. 78(1H, d, J = 2.04Hz，6-H)，8 : 5 ? 90(1H，s，8_H)，8 ：6. 74 ~ 6. 62 (4H, m, 6 " -H, 2，-H, 5，-H, 6，-H)，S :6. 88 (1H, s, 2 " -H)。结合文献数 据(J.L. Torres and R. Bobet, New Flavanol Derivatives from Grape(Vitis vinifera)Byproducts. Antioxidant Aminoethylthi〇-Flavan-3-〇l Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols, J. Agric.Food Chem. 2001，49, 4627-4634)，鉴定化合物4为4 0 - (2-氨基乙硫基）表儿茶素没食子酸酯， 其结构见前面的化合物3。
[0106] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 一种分离羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法，包括下述步骤： (1)将样品进行C18常压柱色谱分离，所述C18常压柱色谱分离为一次或者多次（例如 2、3、4 或 5 次）。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品含有羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代 物； 优选地，所述样品为或者含有如下的a或b : a. 缩合鞣质经过硫解试剂进行降解的产物；或者 b. 含有缩合鞣质的植物提取物（例如含有缩合鞣质的葡萄籽提取物或者含有缩合鞣 质的金荞麦的提取物如威麦宁）经过硫解试剂进行降解的产物； 优选地，上述a或b中所述的硫解试剂为盐酸巯乙胺； 优选地，所述降解在50°C -80°C水浴下进行，时间为5-50min。3. 根据权利要求2所述的方法，其中，a或b中所述的缩合鞣质如下面的式A所示，其中，R1选自H和OH; R2选自OH和下面的式II，4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物如下面 的式I所示， CN 105153092 A _权利要求书_ _2/4 页 其中，R1选自H和0H;R2选自H、OH和式II ; R3选自H、OH和式II ; 并且私和1?3不相同；5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物选自如 下的化合物： 4 β-(2-氨基乙硫基）儿茶素， 4 β-(2-氨基乙硫基）表儿茶素， 4 β-(2-氨基乙硫基）表儿茶素没食子酸酯， 4 β-(2-氨基乙硫基）儿茶素没食子酸酯， 4 β-(2-氨基乙硫基）没食子儿茶素， 4 β-(2-氨基乙硫基）表没食子儿茶素， 4 β-(2-氨基乙硫基）没食子儿茶素没食子酸酯，以及 4 β-(2-氨基乙硫基）表没食子儿茶素没食子酸酯。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤⑴中所述的C18常压柱色谱分离满足如下 的1)至4)项中的任意一项、两项、三项或者四项： 1) 流动相为甲醇水溶液，浓度为2 % -12 %，优选地，浓度为3 % -12 %、4 % -12%、 5% -12%、2% -10%、4% -11%、2%、3%、4%、4· 5%、5%、5· 5%、6%、6· 5%、7%、7· 5%、 8%、8· 5%、9%、9· 5%、10%、10· 5%、11%、11· 5%或 12% ; 2) 所述流动相还含有甲酸或乙酸，其浓度为0.01 % -1 % ;优选地，其浓度为 0· 05 % -ο. 5 %、0· I % -ο. 5 %、0· I % -ο. 4 %、0· I % -ο. 3 %、0· 15 % -ο. 25 %、0· Ol %、 0· 05%、0· 1%、0· 15%、0· 2%、0· 25%、0· 3%、0· 35%、0· 4%、0· 45%、0· 5%或 1% ; 3) 每个流份的体积为 1 -1 5mT,;优选地，为 2-10mL、3-8mL、4-6mL、2、3mL、4mL、5mL、6mL、 7mL、8mL、9mL 或 10mT,； 4) 采用湿法装柱，湿法上样；装柱后用甲醇冲洗至无杂质，再将流动相逐步过渡至起 始比例；优选地，装柱体积为l〇-l〇〇〇mL。7. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤⑴中，通过HPLC检测洗脱流份，将纯度相 同或相近的部分合并，除去甲醇；优选地，还对除去甲醇后的产物进行冷冻干燥。8. 根据权利要求7所述的方法，其中HPLC的条件如下： 色谱柱：Thermo Syoronis C18色谱柱；柱温：30°C ;流速：lmL/min ;进样量：20 yL ;检 测波长：280nm ;流动相：以0. 2%甲酸水（A)和0. 2%甲酸乙腈（B)为流动相梯度洗脱；优选地，洗脱程 序如下面的表2， 表2 〇9. 根据权利要求1所述的方法，其还包括步骤（2)， (2)将步骤（1)中的产物进行半制备HPLC分离； 优选地，半制备HPLC的条件如下： 色谱柱=YMC-Pack ODS-A色谱柱；柱温：30°C ;流速：lmL/min ;进样量：ImL ;检测波长： 280nm ； 流动相：以0. 2%甲酸水（A)和0. 2%甲酸甲醇（B)为流动相梯度洗脱；优选地，洗脱程 序如下面的表3， 表3CN 105153092 A _ 权利要求书 _ _4/4 页〇10. -种制备羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法，包括权利要求1至9中任一权 利要求所述的分离羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法。
【专利摘要】本发明属于天然药物领域，涉及一种缩合鞣质的巯乙胺基取代降解产物的制备方法，特别是涉及一种分离或者制备羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法，包括下述步骤：(1)将样品进行C18常压柱色谱分离，所述C18常压柱色谱分离为一次或者多次。本发明的分离或者制备羟基黄烷类化合物巯乙胺基取代物的方法操作简便，得率高，产物纯度高。具有良好的应用前景。
【IPC分类】C07D311/32, C07D311/40
【公开号】CN105153092
【申请号】CN201510685495
【发明人】孙磊, 乔善义, 刘晓晴, 李姝靓
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月21日