为25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D ;取I份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E ;取I份浓度为5mmol/L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2 μπι针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
[0020]电转染:转染前3天，复苏中国仓鼠卵巢CHO细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+ RPM1-1640于37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI 1640培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用RPMI 1640培养液制成细胞悬液，按5 X 14个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7 X 15个/ml ;去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pDsRed2-Nl(购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒)1ug至体积为10ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，设置电压160V，15ms，I次脉冲参数进行电击(设置参数参照B1-Rad电转染仪说明书)。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml RPMI 1640 (含10%FBS)继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pDsRed2-Nl质粒DNA转染至CHO细胞中。
[0021]转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍。取一半细胞，采用流式细胞仪分选瞬时转染RFP阳性标记细胞(结果见图1);用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率(结果见图2)。
[0022]实施例3 HEK293细胞转染质粒
配制电转染缓冲液:称取 8.94g KCl、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2,加入无菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液；取75份Cytosalts溶液，加入25份Opt1-MEM培养基，得到混合体系A ;取5份RPM1-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B ;取I份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C ;取I份浓度为25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D ;取10份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E ;取5份浓度为5mmol/L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2 μπι针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
[0023]电转染:转染前3天，复苏ΗΕΚ293细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+DMEM于37°C、5% 0)2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入DMEM培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用DMEM培养液制成细胞悬液，按5 X 14个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7 X 15个/ml ;去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pEGFP-ΝΙ (购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒)1ug至体积为10ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，电压110V，25ms，I次脉冲参数进行电击(设置参数参照B1-Rad电转染仪说明书)。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5mlDMEM(含10%FBS)继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pEGFP-Nl质粒DNA转染至CHO细胞中。
[0024]转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，然后，采用流式细胞仪分选瞬时转染GFP阳性标记细胞(结果见图1);用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率(结果见图2)。
[0025]实施例4人肺腺癌细胞A549细胞转染质粒
配制电转染缓冲液:称取 8.94g KCl、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4、0.475g MgCl2,加入无菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液；取50份Cytosalts溶液，加入10份Opt1-MEM培养基，得到混合体系A ;取I份RPM1-1640培养基加入到混合体系A中，得到混合体系B ;取3份PBS缓冲液加入到混合体系B中，得到混合体系C ;取10份浓度为25 mmol/L的HEPES (pH=7.6)加入到混合体系C中，得到混合体系D ;取10份浓度为2 mmol/L ATP加入到混合体系D中，得到混合体系E ;取10份浓度为5mmol/ L谷胱苷肽加入到混合体系E中，混合均匀，用0.2 μπι针头过滤器过滤除菌，得到哺乳动物细胞电转染缓冲液。
[0026]电转染:转染前3天，复苏Α549细胞(中科院上海细胞库)，将细胞放入培养瓶中加10%的FBS+ RPM1-1640于37°C、5% CO2的培养箱中进行培养，转染前一天，传代培养复苏成纤维细胞。吸出培养液，用PBS冲洗3遍，向瓶内加入适量的0.25%胰蛋白酶，5min后加入RPMI 1640培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，离心(1000 rpm, 5 min)后去上清液，用RPMI 1640培养液制成细胞悬液，按5 X 14个/ml的密度传代培养。利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，小心悬浮、计数，细胞数为7X 15个/ml ;去除PBS，利用本发明公开的电转染缓冲液进行悬浮，加入已去内毒素大提质粒pEGFP-Nl (购自Clontech，操作方法参见QIAGEN 12163质粒大提试剂盒)IlOug至体积为10ul的细胞悬液中，再将混合液放入到0.2cm的电击杯中，选择方波条件下，电压150V，10ms，I次脉冲参数进行电击(设置参数参照B1-Rad电转染仪说明书)。将电击后的细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，加入5ml RPMI 1640 (含10%FBS)继续培养。在相同条件下，利用PBS缓冲液和Cytomix缓冲液将pEGFP-Nl质粒DNA转染至A549细胞中。
[0027]转染24小时后，收集悬浮细胞，然后利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，用PBS清洗两遍，然后，采用流式细胞仪分选瞬时转染GFP阳性标记细胞(结果见图1);用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞存活率(结果见图2)。
【主权项】
1.哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤如下: (1)称取8.94g KC1、0.01665g CaCl2U.74 g K2HPO4'0.475g MgCl2，加入无菌水定容至I升，混合得到Cytosalts溶液； (2)取50-100份步骤(I)得到的Cytosalts溶液，加入10-25份Opt1-MEM培养基，得到混合体系A ； (3)取1-5份RPM1-1640培养基加入到步骤(2)得到的混合体系A中，得到混合体系B ；(4)取1-5份PBS缓冲液加入到步骤(3)得到的混合体系B中，得到混合体系C; (5)取1-10份浓度为25mmol/ L、pH值为7.6的HEPES加入到步骤(4)得到的混合体系C中，得到混合体系D ； (6)取1-10份浓度为2mmol/ L ATP加入到步骤(5)得到的混合体系D中，得到混合体系E ； (7)取1-10份浓度为5mmol/ L谷胱苷肽加入到步骤(6)得到的混合体系E中，混合均匀，过滤除菌，得到电转染缓冲液； 以上所加物料的份数均为体积份。2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的哺乳动物细胞。3.根据权利要求1或2所述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的哺乳动物细胞是体外培养的3T3-L1细胞、CHO细胞、HEK293细胞和A549细胞中的任意一种。4.根据权利要求1-3所述的哺乳动物细胞高效电转染缓冲液及其制备方法，其特征在于所述的电转染的基因物质为DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了哺乳动物细胞高效电转染缓冲液，该缓冲液是对Cytomix缓冲液的进一步改良。该缓冲液中加入的无血清Opti-MEM培养基、RPMI-1640培养基及PBS缓冲液能对细胞起营养保护作用，能增加细胞存活率，同时加入的ATP和谷氨酰胺可阻止细胞质成分渗漏，加强细胞膜抗氧化作用，有利于电穿孔的重新闭合。本发明公开的电转染缓冲液，能够明显提高外源基因在目标细胞的电转染效率（高达64.82%），并能提高细胞存活率（高达62.33%）。本发明还提供了该电转染缓冲液的制备方法，该方法操作简单，可操作性强。
【IPC分类】C12N15/85
【公开号】CN105154472
【申请号】CN201510638518
【发明人】周勇, 申友锋
【申请人】重庆高圣生物医药有限责任公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月28日