油。
[0102] 除非另外指明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域 普通技术人员所通常理解的相同的含义。下面描述了示例性的方法和材料，尽管类似或等 同于本发明中描述的那些的方法和材料也可W用于实施本发明且其对本领域技术人员是 显而易见的。本发明中提及的所有公开出版物和其他参考文献整体通过引用并入本文。在 冲突的情况下，本说明书（包括定义）优先。材料、方法和实施例仅是说明性的而不意图是 限制性的。
[0103] 在整个说明书和权利要求中，单词"包括"或其变型如"包含"或"包括有"应被理 解为指包含指定的成分或成分组，但不排除任何其他成分或成分组。 W04]核酸序列
[0105] 本发明提供用于编码酶及其变体的基因的分离的核酸分子。编码酶的基因的示例 性全长核酸序列及其对应氨基酸序列如表1和表2所示。
[0106] 在一个实施方式中，本发明提供了具有包含在感兴趣的宿主细胞中表达的编码烧 基脱甲酯单加氧酶、硫醋酶、簇酸还原酶、憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连 接酶和/或长链酷基-CoA还原酶及其同源物、变体和衍生物的基因或由其组成的核酸序列 的分离的核酸分子。本发明还提供了包含作为本文所述烷基脱甲酯单加氧酶、硫醋酶、簇酸 还原酶、憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和/或长链酷基-CoA还原酶 的密码子优化形式的序列或由其组成的核酸分子。在进一步的实施方式中，本发明提供了 包含作为与野生型基因具有至少80%同一性的烷基脱甲酯单加氧酶、硫醋酶、簇酸还原酶、 憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和/或长链酷基-CoA还原酶的变体 的序列或由其组成的核酸分子W及该分子的同源物、变体和衍生物。核酸序列可W优选与 野生型基因具有高于80%、85%、90%、95%、98%、99%、99. 9%或甚至更高的同一性。
[0107] 在另一个实施方式中，本发明的核酸分子编码具有在表1和表2中公开的氨基酸 序列的多肤。优选地，本发明的核酸分子编码与在表1和表2中示出的氨基酸序列具有至 少50 %、60、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %同一性的多肤序列，且同一性甚至可W更优选为 96%、97%、98%、99%、99. 9%或甚至更高。
[010引本发明也提供在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上文所定义的和 本领域所公知的，严格杂交是在比特定条件集下的特定DNA杂合体的热烙点（Tm)低约25°C 下进行，其中Tm是50%祀序列与完美匹配的探针杂交的溫度。严格洗涂是在比特定条件集 下的特定DNA杂合体的Tm低约5°C的溫度下进行。
[0109] 也提供了包含上述核酸序列中任一个的片段的核酸分子。运些片段优选包含至少 20个连续核巧酸。更优选地，核酸序列的片段含有至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、 100或甚至更多的连续核巧酸。
[0110] 本发明的核酸序列片段在多种系统和方法中显示出用途。例如，片段可在各种不 同杂交技术中作为探针使用。取决于方法，祀核酸序列可W是DNA或RNA。祀核酸序列可W 在杂交前分级分离（如通过凝胶电泳），或者可W对样品进行原位杂交。本领域技术人员 会理解，已知序列的核酸探针在染色体结构确定（如，通过DNA印迹法）或在基因表达测量 中（如，通过RNA印迹法）中具有用途。在运样的实验中，优选可检测地标记序列片段，使 得可W检测和任选地定量其与祀序列的特异性杂交。本领域技术人员会理解，本发明的核 酸片段可W用于本文没有具体描述的广泛印迹技术中。
[0111] 也应当理解，当固定在微阵列上时，本文公开的核酸序列片段也有作为探针的用 途。通过将核酸沉积并固定到载体基板上来制造微阵列的方法是本领域所公知的。其 在DNAMicroarrays=APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(编 者），OxfordUniversityPress(1999)(ISBN:0199637768);NatureGenet. 21(1) (suppl):1-60(1999)!MicroarrayBiochip:ToolsandTechnology,Schena(编者）， EatonPublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000)(ISBN:1881299376) 中综述，运些公开内容通过引用在此全文并入。例如，使用包含核酸序列片段（如本文 公开的核酸序列片段）的微阵列进行基因表达的分析是序列片段在细胞和分子生物学 领域中广泛确认的用途。固定在微阵列上的序列片段的其他用途在Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24:168-173(1999)和Zweiger，IYendsBiotechnol. 17:429-436(1999); DNAMicroarrays:APracticalApproach(PracticalApproachSeries)，Schena(编 者），OxfordUniversityPress(1999)(ISBN:0199637768);NatureGenet. 21(1) (suppl) : 1-60 (1999)；MicroarrayBiochip:ToolsandTechnology，Schena(编者），Eaton PublishingCompany/BioTechniquesBooksDivision(2000) (ISBN:1881299376)中描述， 运些公开内容均通过引用在此全文并入。
[0112] 如本领域所公知的，酶活性可WW各种方式测定。例如，OMP的焦憐酸解可 W用分光光度方式追踪（Grubmeyer等，（1993)J.Biol.Chem. 268:20299-20304)。可 选地，酶的活性可W使用色谱技术追踪，如高效液相色谱法（化ung和Sloan，（1986) J.化romatogr. 371:71-81)。作为另一种可选方式，活性可W通过测定酶活性产生的产 物水平而间接测量。运些水平可W使用包括本领域已知的和描述的氯仿/甲醇水性提 取在内的技术进行测量（Cf.M.Kates(1986)TechniquesofLipidology;Isolation， analysisandidentificationofLipids.ElsevierSciencePublishers，New 化rk(ISBN: 0444807322))。更现代的技术包括使用与质谱联合的气相色谱（Niessen， W.M.A. (2001).Currentpracticeofgaschromatography-massspectrometry.New York,N.Y:MarcelDekker. (ISBN:0824704738))。其他用于鉴别重组蛋白质活性和产 物的现代技术，包括液相色质谱化CM巧、高效液相色谱（HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激 光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-T0FMS)、核磁共振（NMR)、近红外（NIR)光谱、粘度测 定（Knothe，G(1997)Am.Qiem.Soc.Symp.Se;ries，666:172 - 208)、测定游离脂肪酸的滴定 化omers(1997)Fett/Lipid，99 (2) : 52 - 54)、酶学方法度ailer(1991)RreseniusJ.Anal. 化em. 340(3): 186)、基于物理性质的方法、湿式化学方法等，可被用于分析由本发明的生物 体产生的产物的水平与身份。如本领域技术人员所知的，其他的方法和技术也可适合于酶 活性的测量。
[0113] 裁体
[0114] 也提供了包含本发明的上述核酸分子的载体（包括表达载体），如本文所进一步 描述的。在第一实施方式中，载体包括上述分离的核酸分子。在替代实施方式中，本发明的 载体包括与一种或多种表达控制序列可操作地连接的上述核酸分子。因此本发明的载体可 用于通过宿主细胞表达促进烧控产生活性的多肤。
[0115] 可用于在原核生物中表达核酸的载体是本领域中所公知的。
[011引分离的多肤
[0117] 依据本发明另一个方面，提供了由本发明的核酸分子编码的分离的多肤（包括突 变蛋白、等位基因变体、片段、衍生物和类似物）。在一个实施方式中，分离的多肤包含对应 于表1或表2所示的多肤序列的多肤序列。在本发明的替代实施方式中，分离的多肤包含与 表1和表2所示的多肤序列至少85%相同的多肤序列。优选地，本发明的分离的多肤与表 1 或表 2 所示的多肤序列具有至少 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、98. 1%、 98. 2%、98. 3%、98. 4%、98. 5%、98. 6%、98. 7%、98. 8%、98. 9%、99%、99. 1 %、99. 2%、 99. 3%、99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%、99. 9%或甚至更高的同一性。
[0118] 根据本发明的其他实施方式，提供了包含上述多肤序列的片段的分离的多肤。运 些片段优选含有至少20个连续氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或甚至更多的连续氨基酸。
[0119] 本发明的多肤也包括上述多肤序列与异源多肤之间的融合体。异源序列可W，例 如，包括设计为利于纯化（如组氨酸标签）和/或重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋 白质融合体的其他非限制性实例包括允许在隧菌体或细胞表面上展示编码的蛋白质的融 合体，与固有巧光蛋白（如绿色巧光蛋白（GFP))的融合体和与IgGFc区域的融合体。
[0120] 宿主细胞转化体
[0121] 在本发明的另一方面，提供了使用本发明的核酸分子或载体转化的宿主细胞及其 后代。在本发明的一些实施方式中，运些细胞在载体上携带本发明的核酸序列，载体可W是 但不是必须是自由复制载体。在本发明的其他实施方式中，核酸已被整合到宿主细胞的基 因组中。
[0122]在替代性实施方式中，本发明的宿主细胞可W通过本发明的分离的核酸的破坏、 缺失或突变进行的重组来突变，使得相对于缺少该突变的宿主细胞，宿主细胞中的一种或 多种酶的活性被降低或消除。 阳12引 用于产牛威兴賊的碳基产物的洗择的或工括化的微牛物
[0124] 微生物：包括来自古细菌（Archaea)、细菌度acteria)和真核生物巧ucarya)域 (domain)的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生 生物。术语"微生物细胞"和"微小生物"可与术语微生物互换使用。
[0125] 多种宿主微生物可W被转化W产生感兴趣的产物。光能自养生物包括真核植物和 藻类W及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。
[0126] 极端微生物也被认为是适合的生物体。运样的生物体耐受各种环境参数如溫 度、福射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH、氧张力和化学物质。它们包括在80°C下或在高 于80°C下生长的超嗜热微生物如延胡索酸火叶菌（Pyrolobusfumarii);在60-80°C之 间生长的嗜热微生物如灰蓝聚球藻（Synechococ州SIividis);在15-60°C之间生长的中 溫微生物；和在15°C下或在低于15°C下生长的低溫微生物如嗜冷杆菌（Psycbobacter) 和一些昆虫。耐福射生物包括耐福射奇球菌值einococ州Sradio化rans)。耐压生物 包括耐受130Mpa压力的嗜压微生物。耐重力生物体包括嗜压微生物。耐超重力（如 〉lg)低重力（如<lg)生物也包括在内。耐真空生物体包括缓步动物、昆虫、微生物和 种子。耐干燥和脱水生活（anhy化obiotic)的生物体包括耐旱生物如面虫（Artemia salina);线虫、微生物、真菌和地衣。耐盐生物体包括嗜盐生物（如2-5M化Cl)盐杆菌 科化alobacteriacea)和盐生杜氏藻值unaliellasalina)。耐抑生物体包括嗜碱生 物如嗜盐碱杆菌属（化tronobacterium)、坚强芽抱杆菌度acillusfi;rmus)0F4、螺旋藻 属（Spirulinaspp.)(如抑〉9)和嗜酸生物如高溫红藻（切anidiumcaldarium)、铁原体 属（Ferroplasma)(如低pH)。不能耐受化的厌氧生物如詹氏甲烧球菌（Methanococcus jannaschU);耐受一定化的微氧生物如梭菌属（Clostridium)和需要02的需氧生物 也被包括在内。耐受纯C〇2的气体耐受生物体包括高溫红藻，和金属耐受生物体包括耐 金属体如Ferroplasmaacidarmanus(如化、As、Cd、Zn)和青枯菌属（Ralstonia)C册4 种(女日ZruCo、Cd、Hg、Pb)。Gross，Michael.LifeontheEdge:AmazingCreatures ThrivinginExtremeEnvironments.NewYorK:Plenum(1998)和Seckbach，J."Search forLifeintheUniversewithTerrestrialMicrobesWhichThriveUnderExtreme Conditions."InCristianoBatalliCosmovici，StuartBowyer及DanWertheimer编车茸， AstronomicalandBiochemicalOriginsandtheSearchforLifeintheUniverse， p. 511.Milan:EditriceCompositori(1997)。
[0127]植物包括但不限于下列属：拟南芥属（Ar油idopsis)、甜菜属度eta)、大 豆属（Glycine)、麻风树属Qatro地a)、芒属（Miscanthus)、泰属（Pani州m)、龍草 属（Phalaris)、杨属（Populus)、甘薦属（Saccharum)、柳属（Salix)、希蒙得木属 (Simmondsia)和玉蜀泰属狂ea)。
[0128]藻类和蓝细菌包括但不限于下列属：刺菊石属（Acanthoceras)、Acanthococcus 属、Acaryochloris属、曲壳藻属（Achnanthes)、细曲壳藻属（Achnanthidium)、星状藻属 (ActinastrumKActinochloris属、福环藻属（Actinocyclus)、福射鼓藻属 (Actinotaenium)、双金藻属（Amphic虹ysis)、前沟藻属（Amphidinium)、尖粒藻属 (AmphikrAos)、双肋藻属（Amphipleura)、虽形藻属（Amphiprora)、分须藻属 (Amphit虹ix)、双眉藻属（Amphora)、鱼腥藻属（An油aena)、项圈藻属（An油aenopsis)、暗 额藻属（Aneumastus)、纤维藻属（Ankistrodesmus)、错藻属（Ankyra)、异菱藻属 (Anomoeoneis)、虚幻球藻属（Apatococcus)、束丝藻属（Aphanizomenon)、隐球藻属 (Aphanocapsa)、隐毛藻属（Aphanochaete)、隐杆藻属（Aphanothece)、梨囊藻属 (Apiocystis)、顶丝藻属（Apistonema)、四棘鼓藻属（Arthrodesmus)、节旋藻属 (Artherospira)、Ascochloris属、星杆藻属（Asterionella)、绿星球藻属 (Asterococcus)、奥杜藻属（Audouinella)、沟链藻属（Aulacoseira)、杆状藻属 (Bacillaria)、己尔比亚藻属化a化iania)、似竹鼓藻属化ambusina)、红毛莱属化angia)、 鞭毛虫属化asichlamys)、串珠藻属化atrachospermum)、骄胞藻属化inuclearia)、角藻属 化itrichia)、盘苔属化lidingia)、拟气球藻属化otrdiopsis)、气球藻属化otiydium)、葡 萄藻属化otiyococcus)、球葡萄藻属（Botryosphaerella)、咸胞藻属化rachiomonas)、短 纹藻属化rachysira)、短毛藻属化rach^richia)、Brebissonia属、毛革自藻属 化U化ochaete)、柱杆藻属化umilleria)、拟柱杆藻属化umilleriopsis)、美壁藻属 (Caloneis)、眉藻属（Calothrix)、马鞍藻属（Campylodiscus)、盒管藻属（Capsosiphon)、 四鞭藻属（Carteria)、Catena属、Cavinula属、刺棘藻属（Centritrac化S)、Centronella 属、角藻属（Ceratium)、角毛藻属（Qiaetoceros)、Qiaetochloris属、硬毛藻属 (Qiaetochloris)、卡盾藻属（Qiaetonella)、毛丝藻属（Qiaetonema)、盾毛藻属 (Qiaetopeltis)、胶毛藻属（Qiaetophora)、毛球藻属（Qiaetosphaeridium)、管抱藻属 (Qiamaesiphon)、轮藻属（Qiara)Xharaciochloris属、拟小椿藻属（Qiaraciopsis)、小庄 藻属间laracium)、轮藻目（Charales)、缘胞藻属（Chilomonas)、厚胞藻属 (Chlainomonas)、盖毛藻属(Chlamydoblepharis)、Chlamydocapsa属、衣藻属 (Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis属、衣粘藻属（Chlamydomyxa)、Chlamydonephris属、 Chlorangiella属、拟绿囊藻属（Chlorangiopsis)、小球藻属（Chlorella)、绿囊藻属 (Qilorobotrys)、绿幅藻属（Qilorobrachis)、绿点藻属（Qiloroch^rium)、绿球藻属 (Qilorococcum)、绿胶藻属（Qilorogloea)、绿胶球藻属（Qilorogloeopsis)、绿梭藻属 (Qilorogonium)、绿带藻属（Qilorolobion)、拟衣藻属（Qiloromonas)、吊兰属 (Qilorophysema)、绿藻口（Qiloroph^a)、绿胶囊藻属（Qilorosaccus)、背包藻属 (Qilorosarcina)Xhoricystis属、色植藻属（Qiromoph^on)、金光藻属（Qiromulina)、拟 色球藻属（化roococcidiopsis)、色球藻属（Qiroococcus)、色指藻属（Qiroodactylon)、蓝 隐藻属间iroomonas)、色合藻属（Chroothece)、金变形藻属（Chirsamoeba)、金网藻属 (Chrysapsis)、金星藻属（Chrysidiastrum)、金囊藻属（Chrysocapsa)、Chrysocapsella 属、Qiiysochaete属、金色藻属（Qiiysochromulina)、金粒藻属（Qiiysococcus)、 Chrysocri打US属、Chrysolepidomo打as属、Chrysolykos属、Chryso打ebula属、金藻H (Chrysophyt过)、金钟藻属(Chrysopyxis)、Chrysos过ecus属、Chrysoph过erell过属、金环藻 属（Qiiysostephanosphaera)、刚毛藻属（Clodophora)、链抱藻属（Clastidium)、拟新月藻 属（Closteriopsis)、新月藻属（Closterium)、胶球藻属（Coccomyxa)、卵形藻属 (Cocconeis)、Coelastrella属、空星藻属（Coelastrum)、腔球藻属（Coelosphaerium)、帽 球藻属（Coenochloris)、无胶集球藻属（Coenococcus)、聚囊藻属（Coenocystis)、柄裸藻 属（Colacium)、革肖毛藻属（Coleochaete)、Collodictyon属、Compsogonopsis属、弯枝藻属 (Compsopogon)、Conjugatophyta|、1、Conochaete属、Coronastrum属、童支藻属（Cosmarium)、 Cosmioneis属、胶球鼓藻属（Cosmocladium)、Crateriportula属、Craticula属、发毛针藻 属（Crinalium)、十字藻属（Crucigenia)、Crucigeniella属、Cryptoaulax属、隐藻属 (Cryptomonas)、隐藻口（Cryptoph^a)、Ctenophora属、蓝网藻属（Cyanodictyon)、Cyanonephron属、蓝载藻属（Cyanophora)、蓝藻口（Cyanophyta)、蓝杆藻属（Cyanothece)、 Cyanothomonas属、环胞藻属（Cyclonexis)、环冠藻属（Cyclost邱hanos)、小环藻属 (Cyclotella)、简藻属（切Iindrocapsa)、柱胞鼓藻属（切Iindrocystis)、柱抱藻属 (Cylindrospermum)、细柱藻属（Cylindrotheca)、波缘藻属（Cymatopleura)、桥弯藻属 (Cymbella)、Cymbellonitzschia属、胞甲藻属（Cystodinium)、蓝纤维藻属 (Dact^dococcopsis)、单板藻属 〇)ebarya)、细齿藻属 〇)enticula)、Dermatoch:rysis属