径的实例在表3中示出。
[0179] 表3 :通过烧醒脱甲酯单加氧酶产生醒并随后转化为烧控/締控的途径。
[0180]
[0182] 例如，根据标准基因工程技术对生物体（例如，蓝细菌）进行工程化来表达来自运 动发酵单胞菌的Pdc(SEQIDN0:46)和来自点形念珠藻的A血(SEQIDN0:36)。Pdc多肤 将丙酬酸转化为乙醒。A血多肤将乙醒转化为短链烧控甲烧。本发明的基因可通过合成方 式构建或者通过PCR分离。
[0183] 或者，通过重组方式由生物体表达酬酸脱簇酶和Adm。酬酸脱簇酶是来自乳酸乳 球菌乳酸亚种KF147的KivD(SEQIDN0:43)。或者，酬酸脱簇酶是来自酿酒酵母S288C的 AROlO(SEQIDNO:44)。
[0184] 所得生物体包含共表达a血基因和Pdc和/或2-酬酸脱簇酶基因的操纵子。培 养细胞，并通过气相色谱分析测量表3中的预期产物的存在。 阳1财连施例9 :夹自点形念妹荡P(X73102的纯化ADM伸择巧酪脱甲醜化并体外形成择 T院。
[0186]由从DM2. 0(MenloPark,CA;SEQIDNO. 37)获得的密码子优化基因，通过使用 允许引入5'BamHI和3'HindIII限制性位点的引物UN19巧'-CATCACCACAGCCAGGAT CCGATGCAGCAACTGACCGATCAAAGCAAAGAACTGGACTTC-3'）（SEQIDNO:40)和 UN20 巧'-CGGCCCGCCMGCTTTTAGGCACCGATCAGGCCATAGGCGCTCAGACGCATGAT ATC-3'）（SEQIDN0:41)的PCR扩增点形念珠藻PCC73102a血。通过用BamHI和HindIII消化并随后连接，将所得PCR产物插入到大肠杆菌载体pCDF-Duetl(Merck!Darmsta化， Germany)中。将含有N-端HiSg-标记的点形念珠藻a血的所得质粒pCDF-吨U(SEQID NO. 42)转化到大肠杆菌株化21 0E3)中，其随后在IL体积中在补充了IOOiig/mL壮观霉 素的Luria-Bertani培养基中振摇生长至ODe。。= 0. 8,之后用0. 25mMIPTM在化摇瓶中在 37°C下诱导4小时。通过使用Ni-NTA琼脂糖（Qiagen;Valencia，CA)柱的亲和色谱纯化 ADM蛋白质，用抑7. 5的缓冲溶液洗脱纯化的蛋白质，该缓冲溶液含有IOOmM肥阳S、10%甘 油和250mM咪挫。收集的级分的SDS-PAGE凝胶在图13中示出。
[0187] 纯化的ADM的活性在各种不同的短链醒上测试：异下醒、2-甲基下醒和3-甲基下 醒，其中3-甲基下醒（异戊醒）转化为异下烧；而其他两个未示出可检测地脱甲酯W得到 对应烧控。纯化的ADM的活性还在下醒、戊醒和异戊醒上测试，如表4所示。分析条件如 下：~0. 2mM点形念珠藻A血(N-HiSe-标记的）、0.SmM1-甲氧基-5-甲基吩嗦甲基硫酸 盐（Si卵a_Al化ich;St.Louis,M0)、10mMNA畑（Si卵a_Al化ich)、10mM醒（250mM储备液， 溶于二甲基亚讽中），在含有IOOmM肥阳S、10%甘油的抑为7. 4的缓冲溶液中。每次分析 在25°C下运行5分钟，之后立即通过使用2〇-mHP-5MS柱（AgilentTechnologies;Santa Clara，CA)的顶空气相色谱进行分析。柱在40°C下保持3分钟，之后Wl5°C/min加热到 100°C。与购自Sigma-Al化ich的对应标准品相比较，根据保留时间鉴别物质种类。结果在 表4中示出。ADM的表达导致每种产物的峰面积增加。
[0188] 表4:色谱分析结果。
[0189]
[0191]连施巧I10.通_过表达adm、硫.酯酉每矛口carS/entD白勺聚王求藻PCC7002株牛物合成十-- 院并分泌。
[0192] 从耻垢分枝杆菌PCR扩增簇酸还原酶基因（carBHSEQIDNO. 47)，并通过 Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对六组氨酸标记的点形念珠藻a血、加 州月桂化tBm(没有前导序列）和大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DM2. 0(Menlo Park，CA;SEQIDNO. 48、49和50)合成。将具有N端六组氨酸标签的a血基因亚克隆 至具有P(cpcB)启动子、上游/下游同源区和红霉素标记的PUC19载体中。将所得质粒 (口八94::口(。口。8)-化13*曰邑_曰血(化u)-ErmC(SEQIDNO. 51))转化到野生型聚球藻PCC7002 株中，并在红霉素的存在下进行分离（其产生ADM株）。将化tBm、Ca巧和entD基因亚克 隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的PUC19载体中。将所得质粒 (pAQ3::P(nir07)-fatBm-carB-entD-SpecR(SEQIDNO. 52))转化到ADM株中，并在抗生素 壮观霉素的存在下进行分离，获得JCC6036株。
[019引将JCC6036在JB3. 0培养基中在37°C、150巧m下，使用2%C02,并在15mM尿素的 存在下生长至0073。约为3。将细胞离屯、，并在含有3mM尿素的新鲜JB3. 0培养基中再悬浮， 然后将6血十五烧上覆层加到30血培养物上。每天收集0. 06血上覆层并通过配有hp-5ms 柱的GC/FID进行分析。在JCC6036的上覆层中检出增加量的^^一烧（图14)。 阳194]连施例11.向表武a血巧carB/entD的聚球荡P(X7002株喂食葵酸导致檢郷随I对 应的壬糕和分泌。dAQ3上His标巧的A血显示出巧显审.高的体内活性。
[0195] 从耻垢分枝杆菌PCR扩增簇酸还原酶基因（carB)(SEQIDNO. 53)，并通过 Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达进行密码子优化的六组氨酸标记的点形 念珠藻a血和大肠杆菌entD基因由DM2. 0(MenloPark，CA;SEQIDNO. 54和55)合成。将 a血基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子、pAQ3或pAQ4的上游和下游同源区和壮观霉素标记 的口11〔19载体中。将所得质粒（口4〇3::口扣口。8)-化131曰邑_曰血(化11)-5口6。1?(56〇10^.56) 和pAQ4: :P(cpcB)-Nhistag_adm(化u)-EmrC(沈QIDNO. 57))转化到野生型聚球藻PCC7002 株中，并在壮观霉素的存在下进行分离（获得ADM3和ADM4株）。将Ca巧和entD基因亚克 隆至含P(nir07)启动子、pAQ7的上游和下游同源区和卡那霉素标记的PUC19载体中。将 所得质粒（pAQ7::P(nir07) -carB-entD-KanR(沈QIDNO. 58))转化到ADM3 和ADM4 株中， 并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离（获得ADM3CARB和ADM4CARB株）。
[0196]将ADM3CARB和ADM4CARB株在JB3. 0 培养基中在 37°C、150巧m下，使用 2%C〇2,并 在15mM尿素的存在下生长至0〇73。约为4。将细胞离屯、，并在不含尿素的新鲜JB3. 0培养基 中再悬浮，过夜生长W使受P(nir07)启动子调控的蛋白质表达。然后将1.5血十五烧上覆 层加到6mL培养物上，之后在开始时向培养物中喂食4mM癸酸巧OOmM储备液，溶解于100 % 乙醇中）。喂食后1小时和2小时处收集0.OSmL上覆层并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID 进行分析。在喂食癸酸时，壬烧W~6mg/L/h的初始速率由ADM3CARB株体内产生（图15)。
[0197] 已经描述了本发明的大量实施方式。然而，理解可W进行各种各样的改变但不背 离本发明的精神和范围。本文中提到的所有公开出版物、专利和其他文献通过引用在此全 文并入。
[019引
[0199]
【主权项】
1. 一种工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码一种或多种酶的一种或多种重 组核酸序列，所述一种或多种酶具有催化烷烃产生的酶活性，其中所述酶活性包括烷烃脱 甲酰单加氧酶活性及 硫酯酶活性、羧酸还原酶活性和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性； 硫酯酶活性、长链脂肪酸CoA-连接酶活性和长链酰基-CoA还原酶活性；和/或 丙酮酸脱羧酶活性和2-酮酸脱羧酶活性。2. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、羧 酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。3. 权利要求2所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号 4. 1. 99. 5,所述硫酯酶具有EC编号3. 1. 2. 14,所述羧酸还原酶具有EC编号1. 2. 99. 6,和所 述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶具有EC编号2. 7. 8. 7。4. 权利要求2所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，所述硫 酯酶由tesA、fatB或fatB2编码，所述羧酸还原酶由carB编码，和所述磷酸泛酰疏基乙胺 基转移酶由entD编码。5. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有 EC编号4. 1. 99. 5,所述具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3. 1. 2. 14,所述具有羧酸还原酶活 性的酶具有EC编号1. 2. 99. 6,和所述具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的酶具有EC编 号 2. 7. 8. 7。6. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述酶包括烷烃脱甲酰单加氧酶、硫酯酶、长 链脂肪酸CoA-连接酶和长链酰基-CoA还原酶。7. 权利要求6所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶具有EC编号 4. 1. 99. 5、所述硫酯酶具有EC编号3. 1. 2. 14、所述长链脂肪酸CoA-连接酶具有EC编号 6. 2. 1. 3,和所述长链酰基-CoA还原酶具有EC编号1. 2. 1. 50。8. 权利要求6所述的工程化微生物，其中所述烷烃脱甲酰单加氧酶由adm编码，所述硫 酯酶由tesA、fatB或fatB2编码，所述长链脂肪酸CoA-连接酶由fadD编码，和所述长链酰 基-CoA还原酶由acrM编码。9. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述具有烷烃脱甲酰单加氧酶活性的酶具有 EC编号4. 1. 99. 5、所述具有硫酯酶活性的酶具有EC编号3. 1. 2. 14、所述具有长链脂肪酸 CoA-连接酶活性的酶具有EC编号6. 2. 1. 3,和所述具有长链酰基-CoA还原酶活性的酶具 有EC编号 1. 2. 1. 50。10. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催 化酰基-ACP转化为脂肪酸的硫酯酶的重组核酸序列。11. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码使 由羧酸还原酶核酸序列编码的蛋白质的ACP部分磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基 乙胺基转移酶的重组核酸序列。12. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催 化脂肪酸转化为脂肪醛的羧酸还原酶的重组核酸序列。13. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催 化脂肪醛转化为烷烃或烯烃的烷烃脱甲酰单加氧酶的重组核酸序列。14. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催 化脂肪酸转化为酰基-CoA的脂肪酸CoA-连接酶的重组核酸序列。15. 权利要求1所述的工程化微生物，其中所述一种或多种重组核酸序列包含编码催 化酰基-CoA转化为脂肪醛的酰基-CoA还原酶的重组核酸序列。16. 权利要求1-15中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是细菌。17. 权利要求1-16中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是革兰氏阴性细 菌。18. 权利要求1-17中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。19. 权利要求1-18中任一项所述的工程化微生物，其中包含所述一种或多种重组核酸 序列的操纵子的表达受重组启动子控制，其中所述启动子是组成型或诱导型的，并且任选 地，其中adm存在于高拷贝数载体上。20. 权利要求19所述的工程化微生物，其中所述操纵子被整合到所述微生物的基因组 中。21. 权利要求19所述的工程化微生物，其中所述操纵子在染色体外。22. 权利要求1-21中任一项所述的工程化微生物，其中所述微生物是光合微生物。23. 权利要求1-22中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是蓝细菌。24. 权利要求1-23中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是耐热性蓝细 菌。25. 权利要求1-12中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述微生物是聚球藻属 (Synechococcus)的种。26. 权利要求1-25中任一项所述的工程化光合微生物，其中所述烷烃的长度少于或等 于18个碳原子。27. 权利要求1-26中任一项所述的工程化微生物，其中所述烷烃的长度为2至18个碳 原子。28. 权利要求1-27中任一项所述的工程化微生物，其中所述烷烃的长度为2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 个碳原子。29. 权利要求1-28中任一项所述的工程化微生物，其中所述重组核酸序列与表1所示 序列至少90 %或至少95 %相同。30. -种包含培养基和权利要求1-29中任一项所述微生物的细胞培养物。31. -种生产烃的方法，其包括： 在培养基中培养权利要求1-29中任一项所述的工程化微生物，其中相对于在相同条 件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组核酸序列的微生物，所述工程化微生物产生增加 量的烷烃。32. 权利要求31所述的方法，其还包括允许烷烃在所述培养基或所述生物体中积累。33. 权利要求31-32中任一项所述的方法，其还包括分离所述烷烃的至少一部分。34. 权利要求1-33中任一项所述的方法，其还包括处理所述分离的烷烃以产生经处理 的材料。35. -种包含烷烃的组合物，其中所述烷烃由权利要求31-34中任一项所述的方法产 生。36. 权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含至少5%、至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或 至少99 %的烷烃。37. -种用于生产烃的方法，其包括： (i) 在培养基中培养权利要求1-29中任一项所述的工程化微生物；和 (ii) 使所述工程化微生物暴露于光和无机碳，其中所述暴露导致所述无机碳被所述微 生物转化为烷烃，其中所述烷烃以比由在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组 核酸序列的微生物产生的量更大的量产生。38. 权利要求37所述的方法，其还包括允许烷烃在所述培养基或所述生物体中积累。39. 权利要求37-38中任一项所述的方法，其还包括分离所述烷烃的至少一部分。40. 权利要求37-39中任一项所述的方法，其还包括处理所述分离的烷烃以产生经处 理的材料。41. 一种包含烷烃的组合物，其中所述烷烃由权利要求37-40中任一项所述的方法产 生。42. 权利要求41所述的组合物，其中所述组合物包含至少5%、至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或 至少99 %的烷烃。43. -种由工程化微生物产生短链烷烃或烯烃的方法，所述方法包括： a. 在所述工程化微生物中表达重组烷醛脱甲酰单加氧酶（"ADM"）；和 b. 在有效地产生短链烷烃或烯烃的条件下在含有碳源的培养基中培养所述工程化微 生物。44. 权利要求43所述的方法，其中所述ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中所述醛选自 乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、3-甲基-1- 丁醛和2-苯基乙醛。45. 权利要求43所述的方法，其中所述烷烃或烯烃选自甲烧、丙烷、乙烧、丁烧、丙烷、 异丁烷和甲苯。46. 权利要求43所述的方法，其还包括在所述工程化微生物中表达重组丙酮酸脱羧酶 ("Pdc"）。47. 权利要求46所述的方法，其中所述Pdc与SEQ ID NO:46至少90%相同。48. 权利要求43所述的方法，其还包括在所述工程化微生物中表达2-酮酸脱羧酶。49. 权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧酶在受单 一启动子控制的操纵子中表达。50. 权利要求49所述的方法，其中所述操纵子包含ADM。51. 权利要求43-50中任一项所述的方法，其中所述ADM与SEQ ID NO: 36至少90%相 同。52. -种工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码烷醛脱甲酰单加氧酶 ("ADM"）的重组基因，并且所述工程化微生物还包含编码选自丙酮酸脱羧酶和2-酮酸脱 羧酶的酶的重组基因。53. 权利要求52所述的工程化微生物，其中所述ADM催化醛转化为烷烃或烯烃，其中所 述醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、2-甲基-1 - 丁醛、丁醛、3-甲基-1 丁醛和2-苯基 乙醛。54. 权利要求53所述的工程化微生物，其中所述烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烷、丁 烷、丙烷、异丁烷和甲苯。55. 权利要求52所述的工程化微生物，其还包含重组丙酮酸脱羧酶（"Pdc"）。56. 权利要求55所述的工程化微生物，其中所述Pdc与SEQ ID N0:46至少90%相同。57. 权利要求52所述的工程化微生物，其还包含2-酮酸脱羧酶。58. 权利要求55-57中任一项所述的工程化微生物，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧 酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。59. 权利要求58所述的工程化微生物，其中所述操纵子包含ADM。60. 权利要求52所述的工程化微生物，其中所述工程化微生物是工程化蓝细菌。61. 权利要求52-60中任一项所述的工程化微生物，其中所述ADM与SEQ ID NO: 36至 少90%相同。62. -种细胞培养物，其包含重组微生物和含有碳源的培养基，其中当所述重组微生物 在有效地表达催化醛转化为烷烃的多肽的条件下在所述培养基中培养时，所述多肽在所述 重组微生物中过表达，并且烷烃或烯烃在所述细胞培养物中产生。63. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述多肽具有烷醛脱甲酰单加氧酶活性。64. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述醛选自乙醛、丁醛、丙醛、异丁醛、丁醛、 3-甲基-1- 丁醛和2-苯基乙醛。65. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃或烯烃选自甲烷、丙烷、乙烧、丁烷、 丙烷、异丁烷和甲苯。66. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃是短链烷烃。67. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃包含C 2到C 4烧烃。68. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃包含C 2到C 7烷烃。69. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述烷烃或烯烃被分泌到所述培养基中。70. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述多肽包含与SEQ ID N0:36具有至少90% 同一性的氨基酸序列。71. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物还包含包括丙酮酸脱羧酶 ("Pdc"）活性的重组多肽。72. 权利要求71所述的细胞培养物，其中所述Pdc与SEQ ID NO:46至少90%相同。73. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物还包含重组2-酮酸脱羧酶。74. 权利要求71-73中任一项所述的细胞培养物，其中所述Pdc或所述2-酮酸脱羧酶 在受单一启动子控制的操纵子中表达。75. 权利要求74所述的细胞培养物，其中所述操纵子包含ADM。76. 权利要求62所述的细胞培养物，其中所述重组微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、 藻类和细菌。77. 权利要求76所述的细胞培养物，其中所述细菌是蓝细菌。78. -种用于生产异丁烷或异丁烷衍生物的方法，其包括在体外将ADM与醛接触。79. 权利要求78所述的方法，其中所述ADM与SEQ ID NO: 36至少90%相同。80. 权利要求78所述的方法，其中所述ADM是点形念珠藻ADM。81.权利要求78所述的方法，其中所述醛是3-甲基丁醛。
【专利摘要】本申请公开了用于改变作为宿主的光能自养生物的方法和组合物，使得该生物有效产生烷烃，特别是使用这样的生物来商业化生产烷烃及相关分子的用途。也描述了其他材料、方法和组合物。
【IPC分类】C12N1/21
【公开号】CN105164248
【申请号】CN201480017890
【发明人】F·A·斯克瑞利, M·康纳, 李宁
【申请人】焦耳无限科技公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年1月27日
【公告号】EP2948540A2, US20150152438, WO2014117084A2, WO2014117084A3