古细菌如甲焼杆菌属（Methanobacterium)的种、 甲焼短杆菌属（Methanobrevibacter)的种、甲焼嗜热菌属（Methanothermus)的种、 甲焼球菌属（Methanococcus)的种、甲焼微菌属（Methanomicrobium)的种、甲焼螺菌 属（Methanospirillum)的种、产甲焼菌属（Methanogenium)的种、甲焼八叠球菌属 (Methanosarcina)的种、甲焼叶菌属（Methanolobus)的种、甲焼丝菌属（Methanothrix) 的种、甲焼类球菌属（Methanococcoides)的种、甲焼盘菌属（Methanoplanus)的种；极端 嗜热硫代谢菌如热变形菌属（Thermoproteus)的种、热网菌属巧yrodictium)的种、硫化 叶菌属（Sulfolobus)的种、嗜酸菌属（Aci化anus)的种，^及其他微生物如枯草芽胞杆菌 化acillussubtilis)、日卑酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、链霉菌属（Streptomyces) 的种、青枯菌属（Ralstonia)的种、红球菌属（Rhodococcus)的种、棒状杆菌属 (Corynebacteria)的种、短杆菌属化revibacteria)的种、分枝杆菌属（Mycobacteria)的 种和产油酵母菌。
[0135] 依据本发明公开的方法生产焼控的优选生物体包括：拟南芥（Arabidopsis thaliana)、柳枝稷巧anicumvirgatum)、奇岗（Miscan化USgiganteus)和玉米（Zeamays) (植物）；布朗葡萄藻化otiyococcusbraunii)、莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)、 盐生杜氏藻Ounalielasalina)(藻类）；聚球藻PCC7002、聚球藻PCC7942、聚球藻PCC 6803、细长嗜热聚球藻（Thermosynechococcuselongatus)BP-l(蓝细菌）；Qilorobium t邱idum(绿色硫细菌）；禮色绿屈磅菌（Qiloroflexusauranticus)(绿色非硫细菌）；微 温着色菌（Qiromatiumt邱idum)和酒色着色菌（Qiromatiumvinosum)(紫色硫细菌）；深 红红螺菌（Rhodospirillumrubrum)、芙膜红细菌（Rhodobactercapsula化S)和沼泽红假 单胞菌（祂odopseudomonaspalusris)(紫色非硫细菌）。
[0136] 此外其他适合的生物体包括如Venter等.，美国专利公开号2007/0264688 所描述的合成的细胞或由合成的基因组产生的细胞，^及Glass等，美国专利公开号 2007/0269862所述的细胞样系统或合成细胞。
[0137] 此外其他适合的生物体包括可W被工程化W固定二氧化碳的微生物，细菌 如大肠杆菌、醋酸杆菌（Acetobacteraceti)、枯草芽抱杆菌；酵母和真菌如杨氏梭 菌(Clostridium1jungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、产黄青霉 巧enicilliumchrysogenum)、毕赤酵母巧ichiapastoris)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、焚光假单胞菌巧seudomonasfIuorescens)或运动发酵单 胞菌狂ymomonasmobilis)。
[0138] 适合选择和工程化的生物体能够自养固定C〇2到产物中。运包括光合作用和甲 烧生成。乙酸生成，包括S种类型C〇2固定：卡尔文循环、乙酷CoA途径和还原TCA途径也 被覆盖。使用二氧化碳作为细胞碳的唯一来源（自养）的能力在几乎所有主要原核生物 组中发现。组间0)2固定途径不同，而且四种目前已知自养途径没有明确的分布模式。参 见，如F^ichSiG-Igsg-AlternativepathwaysofautotrophicCOzfixation,第 365-382 页.在比G.Schlegel,和B.Bowien(编者），Autotrophicbacteria.Springer-Verlag, Berlin,Germany。还原憐酸戊糖循环（卡尔文-己舍姆-本森循环）代表了几乎所有需氧 自养细菌如蓝细菌中的C〇2固定途径。
[0139] 优选的是工程蓝细菌如聚球藻或嗜热聚球藻种类生产烧控。其他优选的生物体包 括集胞藻、产酸克雷伯菌化Iebsiellaoxytoca)、大肠杆菌或酿酒酵母。其他原核的、古细 菌的和真核的宿主细胞也包括在本发明范围内。
[0140] 在一些方面，由光合生物生产烧控可W使用在PCT/US2009/035937(2009年3月3 日提交）和PCT/US2009/055949(2009年9月3日提交）中描述的组合物、材料和方法进行， 其均出于全部目的而通过引用在此全文并入。 阳1川 威兴賊的碳基产物：挥类巧醇类
[0142] 在本发明的各种实施方式中，可W产生期望的特定链长的控类和/或醇类，或其 混合物。在某些方面中，宿主细胞产生至少一种W下感兴趣的碳基产物：烧控如庚烧、壬烧、 十；烧、十五烧和/或^^一烧。在其他方面，碳链长度范围从〔2到〇2。，例如〔2八3八4、(；、(；、 C,、Cs、Cg、Cl。、C。、C。、C。、。4、。5、Cie、C。、Cig或C2。。因此，本发明提供了适合作为燃料 和化学品使用的不同链长的烧控的生产。
[0143] 在优选的方面，该方法提供了培养宿主细胞W直接分泌产物来容易地回收而不需 要提取生物质。运些感兴趣的碳基产物被直接分泌到培养基中。由于本发明使得能够产生 各种不同的确定链长的控类和醇类，分泌的产物容易回收或分离。因此本发明的产物可W 直接使用或者经最小的处理来使用。 。144]燃料紀合物
[0145] 在各个实施方式中，由本发明的方法产生的组合物被作为燃料使用。运样的燃料 符合ASTM标准，例如柴油燃料油D975-09b的标准规格，和在ASTM规格化1655-68中规定 的JetA、JetA-I和JetB的标准规格。燃料组合物可能需要混合多种产物W产生均匀的 产品。混合过程相对简单，但是确定纳入混合物中的各组分的量要困难的多。因此，燃料组 合物可包括芳香控和/或支链控，如75%的饱和控和25%的芳香控，其中一些饱和控是支 链的而一些饱和控是环状的。优选地，本发明的方法产生一系列控，如Cz-Cn或CW-Cis来改 变浊点。而且，组合物可包含用于增强燃料或发动机性能的燃料添加剂。例如，燃料添加剂 可用于改变冰点/胶凝点、浊点、润滑性、粘度、氧化稳定性、点火性能、辛烧值和闪点。燃料 组合物还可包含，特别是，抗氧化剂、静电消除剂、缓蚀剂、防冰剂、杀生物剂、金属纯化剂和 热稳定改良剂。
[0146] 除本发明的许多环保优势如C〇2转化和可再生资源W外，本文所公开的燃料组合 物的其他优势包括低硫含量、低排放、不含或基本不含醇并具有高十六烧值。 阳147] 连施例1 :过表武acrM的大肠巧荫细胸的谢提取物将月巧醜基-CoA转化为十二 酪巧将葵醜基-CoA转化为葵酪。
[0148] 针对大肠杆菌表达，对不动杆菌M-I种的酷基辅酶A还原酶acrM进行密码子优化 并由DM2. 0(MenloPark,CA;SEQIDNO. 1)合成，在5'端具有NdeI位点和在3'端具有 EcoRI位点。通过使用NdeI和EcoRI消化并随后连接来将获得的基因亚克隆至祀T28a载 体（Novagen)中。将所得含有N-端His6-标记acrM的质粒祀T28a-acrM(SEQIDNO. 2) 转化至购自化W化glandBiol油S的化21 〇)E3)大肠杆菌菌株中，该菌株随后在IL体积中 在补充了 100yg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基中振摇生长至ODe。。= 0. 8,之后用 0. 25mM异丙基0 -D-I-硫代半乳糖化喃糖巧在化摇瓶中在37°C下诱导5小时。图1示出 了证明AcrM蛋白质在含有祀T28a-acrM的化21 〇)E3)大肠杆菌细胞中过表达的SDS-PAGE 凝胶。
[0149] 通过离屯、收集含有过表达的AcrM的大肠杆菌细胞，W1:3 (w/v)比率在肥阳S缓 冲液（IOOmM肥阳S、10%甘油、pH7.W中再悬浮，并通过超声裂解。含有IOOyL总裂解 物、ImM酷基-CoA、3mMNA畑(Sigma-Al化ich)、IOOmM肥阳S、10 %甘油的200yL缓冲溶液在 pH7. 5下在37°C解育30分钟，用100yL乙酸乙醋萃取，并通过配有HP-Sms柱（Agilent， SantaClara,CA)的GC/MS进行分析。如图2所示，总离子色谱灯IC)表明检测到在补充 的NADH的存在下通过含有AcrM的细胞提取物从相应酷基-CoA底物产生的醒，运表明AcrM 能够将月桂酷基-CoA转化为十二醒并将癸酷基-CoA转化为癸醒。
[0150]连施巧I2 ;对表达adm-carS-entP的聚球藻PCC7002株喂食目旨月方酉参导至女'檢颁1|至1|相 麻的酪巧院挥。
[015。 从耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)PCR扩增簇酸还原酶karB)基因 (沈QIDNO. 3)，并通过Genewiz(SouthPlainfield,NJ)进行多引物测序来验证。针对大 肠杆菌过表达，对蓝杆藻（切anothece)a血、大肠杆菌无前导QeaderlessKesA和大肠杆 菌entD基因进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark，CA;SEQIDN0.4和5)合成，在各个 基因的前端具有单个核糖体结合位点。将全部四种基因亚克隆至含有氨抑制型P(nir07) 启动子（美国专利7, 955, 820号）、上游/下游同源区域和壮观霉素标记的PUC19载体中。 将所得质粒，pAQ3::P(ni;r07)-adm-carB-tesA-entD-SpecR(沈QIDNO. 6)转化到野生型聚 球藻P(X7002种中，并在壮观霉素的存在下进行分离。
[0152] 通过GC/FID在转化的聚球藻P(X7002种中检测到十S烧和十五烧证实了A血、 CarB、TesA和化tD蛋白质的表达和活性（图3)。
[015引聚球藻P(X7002种培养物生长到0073。约为5,之后加入ImM脂肪酸（IOOmM乙醇储 备液），然后在十五烧上覆层化血培养物具有1血上覆层）不存在（喂食月桂酸）或存在 (喂食辛酸和癸酸）的情况下，W150巧m、在37°C振摇约3小时。通过配备有HP-Sms柱的 GC/MS分析来自辛酸喂食培养物（图4A和4D)或癸酸培养物（图4B和4E)的十五烧上覆 层。对于月桂酸喂食分析，使用400yL己烧通过1分钟满旋萃取ImL培养物，之后通过GC/ MS对其进行分析（图 4〔、4巧。注意到表达pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-tesA-entD-SpecR 的聚球藻P(X7002株甚至可W在不喂食十二烧酸的情况下产生可检测水平的十一烧。A血 和CarB-起能够在体内产生^--烧。
[0154]连施例3 ;表达adm_GarB_fatS2_entD的聚球藻PCC7002株导至皮在十巿糕上覆层 中檢郷随I的丰院蜡加。
[01 巧]pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-tesA-entD-SpecR的大肠杆菌无前导tesA被專距花 (化地eahookeriana)无前导化巧2 (中等链酷基-ACP硫醋酶）替代，该化tB2是针对大肠 杆菌过表达而进行密码子优化并由DNA2.0(MenloPark、CA;SEQIDNO. 7)合成，具有该 基因前端的单个核糖体结合位点、5'化anI限制性位点和3'化ndIII限制性位点。将所 得质粒pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-fa1:B2-entD-SpecR(SEQIDNO. 8)转化到野生型聚球藻 PCC7002种中，并在壮观霉素的存在下进行分离。
[0156]野生型聚球藻PCC7002 种和表达pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-fa1:B2-entD-SpecR 的聚球藻PCX7002种培养物（35mL)在JB3. 0培养基（下表A)中生长到0〇73。为约3 (在2mM 尿素存在下），之后加入IOmL十五烧上覆层。
[0157]
[0159] 培养物在15化pm、37°C下连续振摇3天W上。在加入十五烧后12小时（图5A)或 72小时（图5B)从各个烧瓶分别取100yL十五烧上覆层样品，并使用配备有20米hp-5ms柱的GC/FID直接进行分析。在表达pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-fa1:B2-entD-SpecR的聚球 藻P(X7002种培养物中检出壬烧产生增加，但在野生型对照中未检出。还在表达pAQ3: :P(n ir07)-a血-carB-fa巧2-entD-SpecR的聚球藻PCC7002种培养物中检出辛烧和庚烧产生相 对增加。A血、Ca巧和化tB2-起在体内产生壬烧。如果体内提供更短的脂肪酸，也可W通 过A血-Ca巧途径产生更短的烧控。 阳160]连施例4 :院挥产牛
[0161] 鉴别并选择编码具有催化烧控产生的酶活性的一种或多种酶的一种或多种重组 基因。酶活性包括：烧控脱甲酯单加氧酶活性、硫醋酶活性、簇酸还原酶活性、和憐酸泛酷琉 基乙胺基转移酶活性、长链脂肪酸CoA-连接酶活性和/或长链酷基-CoA还原酶活性。运 样的基因和酶可W是在表1和表2中描述的那些。
[0162] 将选出的基因克隆到表达载体中。例如，将a血-carB-entD-fatB或 adm-acrM-化曲-fatB(或其同源物的组合）克隆到一个或多个载体中。参见图6。基因可 受诱导型控制（如尿素抑制型nirO?启动子或Climate诱导型cum02启动子）。基因可W操 纵子（operonically)方式表达，也可不通过操纵子方式表达；并且一种或多种基因可被置 于组成型控制之下，W使得当诱导其他基因时，该组成型控制之下的基因也表达。例如，可 W组成型地表达a血、Ca巧和entD，同时将产生脂肪酸的化巧置于诱导型控制之下；因此 当脂肪酸在诱导后由化巧产生时，该途径的其余部分已经存在。
[0163] 选择一种或多种载体并将其转化到微生物（例如蓝细菌）中。细胞生长到适合的 光学密度。在一些情况下，细胞在未诱导的状态下生长到适合的光学密度，然后对其施加诱 导信号W开始烧控产生。
[0164] 通过转化的细胞产生烧控。烧控通常具有7、8、9、10、11或更多个碳原子。在一些 情况下，检测到烧控。在一些情况下，定量烧控。在一些情况下，收集烧控。
[0165] 在一些方面，可W使用硫醋酶如化巧。为测试化巧的下游，随无机碳（例如C〇2) 一起向细胞喂食各种不同链长的脂肪酸，并监测烧控产生。在加入化巧后，向细胞提供无 机碳（例如C〇2)，并监测烧控产生。
[0166]连施巧I5. 向表戍adm、硫.酯酉每矛口carS/entD白勺聚王求藻PCC7002株喂食癸酉参矛叶二 院酸导致檢郷随I巧麻的丰院巧H院巧分泌。
[0167]从耻垢分枝杆菌PCR扩增簇酸还原酶（carB)基因（SEQIDNO. 18)，并通 过Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对点形念珠藻a血、加州月桂 (Umbellulariacali化;rnicia)fatBm(其中下标"m"表示成熟蛋白质，即没有前导序列）和 大肠杆菌entD基因进行密码子优化并由DM2. 0(MenloPark,CA;SEQIDNO. 19、20和21) 合成。将a血基因亚克隆至具有P(cpcB)启动子（美国专利7, 794, 969号）、上游/下游 同源区和红霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒（pAQ4::P(cpcB)-a血wpu-e;rmC(SEQID NO. 22))转化到野生型聚球藻P(X7002株中，并在红霉素的存在下进行分离（运产生ADM 株）。将化化、CarB和entD基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观 霉素标记的pUC19 载体中。将所得质粒（pAQ3::P(ni;r07)-fatBm-carB-entD-SpecR(SEQID NO. 52))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离。
[0168] 将上述最终株的培养物在JB3. 0培养基中在37°C、150巧m下，使用2%C〇2,并在 15mM尿素的存在下生长至0〇73。约为6。将细胞离屯、，并在不含尿素的新鲜培养基中再悬浮， 过夜生长W使受P(nir07)启动子调控的蛋白质表达。然后将1.5mL十六烧的上覆层加到 6mL培养物上，之后向培养物中每2小时喂食0.ImM癸酸或十二烧酸（200mM储备液，溶解于 100%乙醇中）。在2小时和4小时，收集0. 15mL上覆层（S角形）和0. 6mL水性培养物样 品（圆圈），并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在喂食癸酸时，壬烧W>2. 2mg/ LA的初始速率在体内产生，其中超过90%被分泌到上覆层中（图7A)。在喂食十二烧酸 时，^^一烧W1. 2mg/L/h的初始速率在体内产生，其中~50%在4小时后分泌（图7B)。运 表明十一烧产物随时间自发地分泌到细胞外的上覆层中。 阳16引 连施例6.通过表武a血、硫酷酶巧carB/entD的聚球荡P(X7002株牛物合成丰院 巧H院并分泌。
[0170] 从耻垢分枝杆菌PCR扩增簇酸还原酶基因（carBHSEQIDN0.24)，并通过 Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对点形念珠藻a血、加州月桂化tBm(其 中下标"m"表示成熟蛋白质，即没有前导序列）、專距花化巧2m和大肠杆菌entD基因进行 密码子优化并由DM2. 0(MenloPark，CA;SEQIDNO. 25、26、27和28)合成。将a血基因 亚克隆至具有P(cpcB)启动子、上游/下游同源区和红霉素标记的PUC19载体中。将所得 质粒（pAQ4::P(cpcB)-a血Npu-ermC(SEQIDNO. 22))转化到野生型聚球藻PCC7002 株中， 并在红霉素的存在下进行分离（其产生ADM株）。将化tBm、Ca巧和entD基因亚克隆至含 P(nir07)启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的PUC19载体中。将所得质粒（pAQ3: :P(nir07)-fatBm-carB-entD-SpecR(SEQIDNO. 52))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉 素的存在下进行分离，获得ALK-Cll株。将化巧2m、Ca巧和entD基因亚克隆至含P(nir07) 启动子、上游/下游同源区和壮观霉素标记的PUC19载体中。将所得质粒（pAQ3::P(nir07 )-fatB2m-carB-entD-SpecR(SEQIDNO. 31))转化到ADM株中，并在抗生素壮观霉素的存在 下进行分离，获得ALK-C9株。
[0171] 将ALK-C9(图8A)和ALK-Cll(图8B)在JB3. 0培养基中在37°C、150巧m下，使用 2%C〇2,并在15mM尿素的存在下生长至0〇73。约为3。将细胞离心并在不含尿素的新鲜培 养基中再悬浮，然后将SmL十六烧上覆层加到32mL培养物上。每天收集0.ImL上覆层并 通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分析。在ALK-C9的上覆层中检出增加量的壬烧（图 9,圆圈），和在ALK-Cll的上覆层中检出增加量的^^一烧（图9，S角形）。通过ALK-C9和 ALK-Cll从C02连续产生壬烧和^^一烧。 阳17引连施例7 :通过表武a血、tesA(硫酷酶）巧carB/entD的聚球荡P(X7002株牛物 合成十立院巧十巿院。
[0173]从耻垢分枝杆菌PCR扩增簇酸还原酶基因（carB)(SEQIDNO. 32)，并通过 Genewiz的多引物测序验证。针对大肠杆菌过表达，对蓝杆藻ATCC51142a血、大肠杆菌 tesAm(其中下标"m"表示成熟蛋白质，即没有前导序列）和大肠杆菌entD基因进行密码子 优化并由DM2. 0(MenloPark,CA;分别为SEQIDNO. 33和34)合成，在各个基因前端具有 单个核糖体结合位点。将全部四种基因亚克隆至含P(nir07)启动子、上游/下游同源区和 壮观霉素标记的pUC19载体中。将所得质粒（pAQ3: :P(ni;r07)-a血-carB-tesAm-entD-Spec R(SEQIDNO. 35))转化到野生型7002株中，并在抗生素壮观霉素的存在下进行分离，获得 ALK-C13C15 株。
[0174] 将0D730为约0. 5的ALK-C13C15在摇瓶中在37°C、150巧m下，使用2%C〇2,并 在2mM尿素的存在下在JB3. 0培养基中生长。在48小时后，收集0. 5mL培养物样品，并在 15000巧m下离屯、5分钟。用丙酬提取细胞团块，并通过配备有hp-5ms柱的GC/FID进行分 析。图10。类似处理不表达tesAm、carB或entD蛋白质的对照株，并通过相同方法制备和 分析样品。
[0175] 也在十天的时间内分析ALK-C13C15的生长和烧控产生。图11示出ALK-C13C15 在10天期间的生长曲线。图12示出由ALK-C13C15在10天期间的十S烧和十五烧产生曲 线
[0176] 使用0)2和日光，在体内通过40(-〔9和ALK-Cll连续产生壬烧和^^一烧。 。177]连施例8 :庶链院挥酶合成的旅巧。
[0178] 构建表达a血（烧醒脱甲酯单加氧酶）和导致短链醒形成的途径两者的生物体。运 样的醒产生途