~16h ;
培养结束后，挑取LB平板上的阳性单克隆菌落，用菌落PCR筛选阳性克隆。同时接种到Amp终浓度为0.lmg/mL的液体LB中，37°C、220 r/min培养12~16 h ;用solarb1质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切验证。
[0031](2)诱导表达，具体为:
对步骤(I)中鉴定正确的阳性克隆接种到Amp终浓度为0.lmg/mL的LB培养基上，37°C培养 12~16h ；
吸取2mL菌液接种到200mL Amp的终浓度是0.lmg/mL液体LB培养基中，37°C、220r/min培养2h?3h至OD值达到0.6左右；
加入IPTG使终浓度是0.6mmol/L，180 r/min ,28°C培养8h，进行诱导表达。
[0032](3)获得酶 pulA-N31，具体为，
取步骤(2)中菌液，4°C、6000 r/min、离心lOmin，收集菌体，加入I XE/ff (pH7.0)使菌体充分混勾，放置冰上进行超声波破碎(3s X 4s X 99次)，4°C、6000 r/min，离心30min，将上清4°C保存；
将上述上清分装到1.5mL的离心管中，4°C、12000 r/min离心30min，弃沉淀，上清液即为粗酶液；结果如图6所示。
[0033]Co2+螯合琼脂糖凝胶即可得到纯化的PU1A-N31，结果如图7所示。
[0034]实验检验
对于所制备提纯后的pulA-N31的酶学性质，申请人做了进一步的分析测定，并与野生型酶pulA(野生型的普鲁兰酶基因连接在PET21a上，并在大肠杆菌BL21中表达，具体步骤可参考上述实施例1、2，不再重复介绍说明)的酶学性质进行比较，简要介绍如下。
[0035]最适pH值的测定
首先配制不同pH的柠檬酸-磷酸缓冲液，pH依次为:4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8 ;然后在45°C条件下保温15min，测定pulA_N31的酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，以灭活的酶液作为对照。
[0036]结果如图8所示。测定结果表明，pulA_N31的最适pH是5.6，与pulA (野生型原始普鲁兰酶)相比，PU1A-N31的最适pH向酸性范围偏移了 0.4个单位，说明本发明所提供的新的普鲁兰酶PU1A-N31更加适用于酸性环境。
[0037]最适温度的测定
首先设置不同的温度梯度:38°C、42°C、45°C、48°C、51°C、54°C ;然后在最适pH下测定其酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，将灭活的酶液作为对照。
[0038]结果如图9所示。测定结果表明，pulA_N31的最适温度为45°C，与pulA的最适温度相同，说明本申请所提供的新的普鲁兰酶PU1A-N31虽然氨基酸序列受到了截短，但是对酶的作用温度没有明显的影响。
[0039]半衰期的测定
对所制备的粗酶液直接进行半衰期的测定，具体为:每隔两分钟取出(从2min至30min)取出100 μ L酶液，然后在pulA_N31酶的最适温度、最适pH下测定其残余酶活，每个反应设置3个平行求其平均值，把没有保温处理的酶活设定为100%。
[0040]结果如图10所示。测定结果表明，pulA-N31的半衰期是37min，与pulA相比，PU1A-N31的半衰期得到了很大的提高，是pulA的6.17倍。推测其原因是N段区域具有较大的柔性，这些结构域会对普鲁兰酶的稳定性造成负面影响。
[0041]普鲁兰酶酶活的测定
利用DNS法测定普鲁兰酶的酶活，具体为，在冰浴条件下，每100 μ L酶液，加入100 μ Ll%普鲁兰糖、?οομ?的缓冲液，45°C保温15min，
加入600 μ L DNS溶液终止反应，煮沸10 min显色，冷却后用蒸馏水定容至5 mL，混匀，在540 nm波长下测定还原糖含量(以葡萄糖计)；
以灭活后的酶加入底物的酶液作为空白对照。
[0042]酶活定义:在最适条件下，以每分钟水解普鲁兰糖产生相当于IMfflol麦芽三糖的还原力所需要的酶量定义为一个酶活单位(IU)。
[0043]测定结果表明，本发明所提供的突变体酶pulA-N31的比酶活为582.204 U/mg，而pulA比酶活是362.316 U/mg，本发明所构建的pulA_N31的比酶活是pulA的1.6倍。
[0044]酶促动力学性质测定
利用普鲁兰糖为底物，分别配制0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%的溶液，取100 μ L酶液与100 μ L不同浓度的底物在其最适温度和pH条件下反应8min，检测其酶活；
通过计算还原糖浓度，算出不同底物浓度下酶的不同反应速度V ;
根据Hanes-Woolf双作图法以[S]/V_[S]作图，得到一条直线，横轴的截距为_Km，斜率为Ι/Vmax，通过计算得到Km，Vmax以及Kcat值等。
[0045]结果如图11所示。动力学分析显示，以普鲁兰糖为底物时，pulA-N31的Vmax、Kcat、Km和 Kcat/Km 分别为 0.0013 MmoL/mL.S、191.80 S \θ.30 mg/mL、693.30，与 pulA相比，pulA-N31的Km值减小，即与底物亲和力增加，同时催化效率是pulA的2倍。
【主权项】
1.一种普鲁兰酶产酶基因，其特征在于，与保藏编号CGMCC N0.10357的变栖克雷伯氏菌HN7的野生型普鲁兰酶基因相比，其信号肽N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2.权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因所编码的普鲁兰酶pulA-N31，其特征在于，普鲁兰酶pulA-N31的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。3.权利要求2所述普鲁兰酶pulA-N31的制备方法，其特征在于，首先构建含有权利要求I所述普鲁兰酶产酶基因的载体pET21a-pulA-N31，然后将该载体用于制备普鲁兰酶pulA-N3104.含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体，其特征在于，通过下述步骤制备而成: (1)提取基因组DNA，提取变栖克雷伯氏菌HN7的基因组DNA; (2)PCR扩增，具体为，以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，设计如下引物序列，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶pulA基因，扩增产物切胶纯化后保存备用； 引物序列设计如下:上游引物 F: 5' -TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT -3'， 下游引物 R: 5' -AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3'； (3)构建pMD19-pulA质粒，将步骤(2)中PCR扩增产物与pMD19_T质粒连接； (4)构建pET21a- pulA表达载体，将步骤(3)中测序正确的pMD19_pulA质粒进行Ndel , Notl双酶切16h，回收目的条带并连接； (5)反向PCR，以步骤(4)中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，设计引物，反向PCR扩增获得去除信号肽N端截去31个氨基酸基因序列的线性序列产物，线性序列产物切胶纯化后保存备用； 引物序列设计如下: 上游引物 F-N31:5' -CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3'， 下游引物 R-N31:5' -GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3'； (6)酶连获得pET21a-pulA-N31表达载体，将步骤(5)中所获得线性序列产物进行酶连接构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后用Dpn I对酶连体系进行酶切处理。5.权利要求4所述含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，其特征在于，具体步骤如下: (1)热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，将所构建的pET21a-pulA-N31表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，培养，获得构建正确的普鲁兰酶截短突变体工程菌； (2)诱导表达，将步骤(I)中鉴定正确的阳性克隆接种到LB培养基中培养，IPTG诱导表达； (3)获得酶pulA-N31，取步骤(2)中菌液破碎、离心，搜集上清液即为粗酶液。6.如权利要求5所述含有权利要求1所述普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，其特征在于，采用Co2+螯合琼脂糖凝胶纯化粗酶液。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高普鲁兰酶比酶活和热稳定性的普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体、及该载体在普鲁兰酶制备中的应用。该基因与保藏编号CGMCC？NO.10357的变栖克雷伯氏菌HN7的野生型普鲁兰酶基因相比，其去除信号肽后N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表所示。本发明同时利用基因工程手段提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于普鲁兰酶制备后，与原始出发菌株变栖克雷伯氏菌HN7（<i>Klebsiella</i><i>？variicola</i>？？HN7）相比，所制得的普鲁兰酶的比酶活、热稳定性以及对普鲁兰糖的底物亲和能力和催化效率都有了极大提高，显现出较好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/44, C12N15/56
【公开号】CN105200070
【申请号】CN201510614902
【发明人】王明道, 郭双, 聂慧慧, 张雨杭, 焦国宝, 陈晓慧, 孙利鹏, 邱立友, 时延光, 王红阳, 郜峰, 原增艳, 付香斌
【申请人】河南仰韶生化工程有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日