一种肝癌诊断剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的准确诊 断具有重要的现实意义。
[0003] 现时，国际上通常用来筛查肝癌的生物标志物是血清AFP(甲胎蛋白）。但其敏感 性只有39%至65%，特异性只有76%至94%。由于其检测肝癌的敏感性跟特异性不甚理 想，因此美国的治疗指南不推荐血清AFP用于肝癌的诊断。中国跟欧洲的治疗指南都指出， 正常个体的AFP水平应小于20ng/ml，大于400ng/ml则可提示肝癌的诊断。而20至400ng/ ml则是诊断的"灰色地带"。因此利用AFP筛查肝癌容易导致误诊漏诊。
[0004] 除了血液取样方式，另一种诊断方式是组织取样诊断。然而，肝组织取样对人体破 坏性强，因此，亟须一种没有创伤式而准确的诊断方法。
[0005] 人体唾液腺中存在许多毛细血管网，因此，唾液是血液循环的末端产物。血液中存 在的分子物质，例如DNA、RNA、蛋白、药物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被认为是人 体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。 美国的食品及药物管理局（FDA)已经批准了利用唾液检测药物滥用、HIV感染、激素水平、 中毒等试剂在市场上应用，现已在全美都已经得到普及。在临床中，于唾液中寻找分子标记 物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者 易于掌握等优点。研究已经证实了唾液中的转录物、蛋白、代谢物和其他分子物质能检测出 口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥综合征等其他口腔或者系统性疾病。体内的长链非编码 RNA(lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)与包括肝癌在内的多种癌症的发病与发展密切 相关。研究发现多种IncRNA和miRNA在肝癌组织中表达失调，组织中表达失调的IncRNA 和miRNA可作为生物标记物对肝癌有较佳的诊断价值。但唾液IncRNA和miRNA是否可作 为生物标记物协助诊断肝癌，目前尚无报道。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种用于诊断肝癌的唾液检测试剂和试剂盒。
[0007] 本发明同时提供了试剂盒的使用方法。
[0008] 本发明还提供以唾液作为检测样本的方法。
[0009] 发明首先提供了用于诊断肝癌的唾液检测试剂，该试剂为H19、miR-21和miR-222 检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。
[0010] 发明同时提供了H19、miR-21和miR-222唾液检测试剂在制备检测肝癌试剂或试 剂盒中的应用。
[0011] 以唾液作为样本来进行肝癌标记物的检测，最大的难点在于，需要寻找到能分泌 到唾液中的，且在唾液中能稳定存在的标记物。尽管目前已有大批的肝癌标记物被发现，这 些标记物存在于组织样品或血液样品中，然而，同样的标记物采用唾液样本取样，往往是另 一个结果，不能用作肝癌诊断。这很可能是因为能被分泌到唾液中的标记物本身就很少，并 且唾液中存在大量的酶，标记物容易降解。因此，以唾液样本检测肝癌，在此前仍未见任何 报道。
[0012] 而本发明的一大突破在于，发明人发现，在肝癌患者中其唾液样本存在大量的 H19、miR-21和miR-222。其稳定而大量地存在，能被高重现性地检出。而正常样本中，该标 记物表达水平非常低。这使得H19、miR-21和miR-222成为一种良好的唾液样本标记物，对 于肝癌的检测或诊断具有突破性的意义。
[0013] 本发明进一步提供给了用于诊断肝癌的唾液检测试剂盒，其含有蛋白酶和H19、 miR-21和miR-222检测试剂。
[0014] 1.上述的H19、miR-21和miR-222检测试剂含有检测用引物，所述引物的序列如 H19 为SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 ;miR-21 为SEQIDN0. 3 和SEQIDNO. 4 ;miR-222 为 SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6 所示。
[0015] 作为可选的实施方式所述的蛋白酶选自蛋白酶K。
[0016] 优选地，所述的试剂盒还含有酸酚氯仿混合物。并且进一步优选地，还可含有 DEPC(焦碳酸二乙酯）。
[0017] 可选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；优选地；苯酚与氯仿 的体积比为（4. 5-5. 5) : 1 ;更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4. 3-4. 7。
[0018] 发明还提供给了一种检测唾液H19、miR-21和miR-222的方法，包括以下步骤：提 取唾液中总RNA后，进行H19、miR-21和miR-222的逆转录，再通过qPCR(定量聚合酶链反 应）分别检测H19、miR-21和miR-222水平。
[0019] 提取唾液总RNA的方法可采用以下步骤：
[0020] S1.取唾液样本，加入蛋白酶，60_65°C孵育以去除唾液蛋白；
[0021] S2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g离心4-6分钟，收集上清；
[0022] S3.加入1. 25倍体积的乙醇，再经5000-6000g离心20-60秒过滤离心，弃滤液；
[0023]
[0024] S4.加入预热的DEPC水，10000-12000g离心 20-60 秒，收集RNA。
[0025] 本发明首次在唾液中寻找到诊断肝癌敏感特异的生物标记物--H19、miR-21和 miR_222 〇
[0026] 通过统计学分析，建立logistic回归预测诊断肝癌的模型，再构建ROC曲线可得 出联合唾液miR-21、miR-222和H19三种分子物质对肝癌诊断的价值。预测模型的公式为： logit= -2. 153+miR-21X0. 018+miR-222X0. 174+H19X0. 174。SP，将检测到的miR-21， miR-222和H19的表达量代入上述公式，我们前期研究得出正常个体的值应小于3. 939813。 若受检个体检测到的miR-21，miR-222和H19的表达量代入模型公式后结果大于此值，则受 检个体判定为肝癌的敏感性为81. 4%，特异性为91. 8% .
[0027] 唾液H19、miR-21和miR-222在成为协助筛查乙肝相关性肝癌的标志物方面具有 良好的前景，收集唾液的取样方式简单、方便、无创、价廉、不会引起患者不安、操作者易于 掌握、受检者易于接受，且准确率高，对肝癌的早诊早治，降低死亡率，减轻我国的医疗负担 具有重大的意义。
【附图说明】
[0028] 图1为不同肝组织样本中的H19(图1A)、miR-21(图1B)、和miR-222(图1C)表 达水平。
[0029] 图2为不同人群唾液样本中的!119(图24、8)、1^1?-21(图2(：、0)、和1^1?-222(图 2E、F)表达水平。
[0030] 图 3 为联合唾液H19、miR-21 和miR-222 检测结果的R0C(ReceiverOperating Characteristic)曲线。
[0031 ] 图4为肝癌患者的血清AFP水平。
[0032]图5为不同AFP表达水平患者的唾液H19 (图5A)、miR-21 (图5B)、和miR-222 (图 5C)检出水平。
[0033] 图 6 为H19(图 6A)、miR_21(图 6B)和miR_222(图 6C)的qPCR扩增曲线（图 6A), 和H19(图 6D)、miR-21(图 6E)、和miR-222(图 6F)的溶解曲线。
[0034] 图7为MALAT1 (图7A)和miR-224 (图7B)的肝组织样本检测结果。
[0035] 图8为MALAT1 (图8A)和miR-224 (图8B)的唾液样本检测结果。
【具体实施方式】
[0036] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发 明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发 明的保护范围。
[0037] 实施例1唾液采集
[0038] 在唾液采集前，研究个体需禁食、禁饮、禁烟和禁止口腔清洁2h以上。
[0039] 为增加唾液收集量，采用2%柠檬酸溶液湿润无菌棉签棉花头，然后将棉花头放于 研究个体舌头一侧的后侧壁约5s，吐出唾液后，再将棉签放到另一侧的舌头后侧壁。如此 反复收集。唾液收集量需达5ml以上，收集管使用50ml无菌无酶离心管。4°C、3000g离心 15min取上层上清至1. 5mlEppendoff管，再以4°C、12000g离心lOmin后再弃沉淀取上清。 标本处理后均置-80°C保存。
[0040] 实施例2唾液总RNA的提取
[0041] 1.将1ml唾液平均分装在两支1. 5ml的无酶EP管上，即每支EP管都盛有500μ1 的唾液，然后向每只ΕΡ管加入蛋白酶K(20mg/ml) 15μ1，混匀，放于65°C水浴锅孵育过夜。 因为唾液中含有较多的消化酶类等蛋白，影响后续提取唾液RNA的效果，因此此法可去除 唾液蛋白对实验的影响。
[0042] 2.两支EP管各加0· 5ml的酸酚氯仿混合物（主要成分为盐酸、苯酚与氯仿）到上 述唾液混合液中。
[0043] 酸酚氯仿的配置
[0044] 2. 1苯酚与氯仿的比例为：5:1
[0045] 2. 2用浓盐酸调pH值，pH值定在4. 5左右，此pH值最利于提取RNA。混匀。
[0046] 3.加入后手动摇匀30到60秒
[0047]4.室温下10000g离心5分钟。离心后中层液体需紧致，否则重新离心。
[0048] 5.收集上清，需谨慎，不能搅动下层液相。
[0049] 6.将1. 25倍体积的100%乙醇加到上清液中。例如收集到500μ1上清，则加 625μ1无水乙醇。
[0050] 7.将过滤管放入收集管内，将上述混合物加到过滤管中（过滤管和收集管市场上 有销售）。
[0051] 8. 6000g离心30秒。
[0052] 9.丢弃过滤液。重复空甩离心1次。保留收集管。
[0053] 10.将700μ1的75%乙醇加到过滤管中，离心15秒。丢弃过滤液。将过滤管重 新放入原来的收集管中。
[0054] 11.重复第10步，再洗涤一次。
[0055] 12.丢弃过滤液，将过滤管放入同样的收集管中。空甩离心1分钟。
[0056] 13.将过滤管放入新的收集管中。加入95°C预热DEPC7K。盖好盖子。离心30秒。 收集RNA。
[0057] 14.收集洗脱液。洗脱液即溶解有从唾液中提取的