TrapF2/TrapR2分别组合进行套式PCRo第一轮PCR反应的混合液总体积为25 μ 1，包括:0.5 μ Μ引物，4种dNTP各50 μ M，
2.5 μ 110 XPCR 反应缓冲液，2mM 的 Mg2+，3.8 μ Tris.Cl 溶液，4.2 μ KC1 溶液，2.5 μ 11 %BSA, 0.5 μ 1 吐温-20，1.25 单位 Taq 酶(TaKaRa)，模板 DNA 若干，在 PTC200 (MJ 公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为:94°C预变性5min ;然后进入循环，96°C变性30seC，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。取1 μ 1第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮反应，反应体系和反应程序同所述的常规反应体系及程序，反应结束后取7 μ 1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。
[0020]制备DNA模板:
提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下:
一、菌丝粉DNA的抽提
取少量菌丝粉，加900 μ 12% CTAB提取液和90 μ 110% SDS，漩涡混匀，于55°C水浴lh，中间每lOmin上下颠倒几次。12000rpm离心lOmin，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)，颠倒混勾，12000rpm离心lOmin ;将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勾，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc (pH5.2)，_20°C沉淀(> lh)。12000rpm 离心 lOmin，倾去上清，沉淀用 70% 乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH8.0)溶解沉淀(含20 μ g/mlRNase)，37°C处理lh后，-20°C保存备用。
[0021]二、卵孢子悬浮液的制备和DNA的提取:将含有卵孢子的培养基转移到灭菌容器中，加水100ml左右(视容器大小而定)，6000转/分匀浆2分钟，以破碎培养基并使卵孢子与菌丝和琼脂脱离。匀浆液依次经200、300、600目筛网过滤，用水反复冲洗各目筛网，最后用少量灭菌水洗下600目筛网上收集到的卵孢子，制备成卵孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中卵孢子的数目进行计数，将卵孢子的浓度调整为100个/ μ 1，用试剂盒(Q-B1geneLtd，USA)提取 DNA。
[0022]三、游动孢子悬浮液的制备和DNA的提取
诱导大豆疫霉释放游动孢子，滤去菌丝块，得到游动孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中卵孢子的数目进行计数，将游动孢子的浓度调整为1000/μ 1。将游动孢子悬浮液加入到
1.5ml的eppendorf (EP)管中，12000g离心lOmin，弃上清液，取沉淀物，按方法1.4.1提取DNA。将提取的DNA用灭菌超纯水溶解，-20°C保存备用。
[0023]四、活体组织中病原菌DNA的提取
取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ 1的0.5MNa0H，在研钵中充分研磨后转移至 1.5ml 的 EP 管中，12000rpm 离心 5min，取 5 μ 1 上清液加入 495 μ 10.1mMTris (pH8.0)，混匀后取1 μ 1直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在，用本方法提取健株组织DNA后经通用引物ITS1/ITS4扩增ITS片段作为空白对照。
[0024]五、土壤中病原菌DNA的提取
所有的土壤样品采用SPIN试剂盒(Q-B1geneLtd，USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。用作对照的土样采自没有发病的健康田块。
[0025]检测引物的特异性:分别用真核生物通用引物ITS1/ITS4和特异引物TrapFl/TrapRl对26个疫霉种、29个其它种的菌株共计232株进行了 PCR扩增，试验中所有菌株均为单孢菌株，保存于南京农业大学植物病理系。表明根据大豆疫霉转座子序列设计的引物具有种的特异性，可以将P.sojae和其它疫霉种和真菌区分开。
[0026]检测引物的灵敏度:
1、大豆疫霉基因组DNA的灵敏度检测
将大豆疫霉菌株6497的基因组DNA从lng/ μ 1开始10倍向下稀释至10ag/ μ 1，每浓度梯度取1 μ 1为模板用特异引物TrapFl/TrapRl进行PCR扩增。结果表明在25 μ 1的反应体系中含有10pg的基因组DNA时该对引物仍然可以扩增得到267bp的特异性条带。
[0027]先以引物TrapFl/TrapRl对上述不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再以大豆疫霉特异引物TrapF2/TrapR2进行套式PCR扩增。结果表明，套式PCR产物量与单独进行特异性引物扩增的PCR产物量相比有明显提高，能够使原来条带亮度非常微弱或者不可见扩增条带的样品产生明显的条带，表明以引物TrapFl/TrapRl和所设计的TrapF2/TrapR2引物组合进行的套式PCR反应可以使检测灵敏度提高1000倍，能够检测到10fg的基因组DNA。
[0028]2、大豆疫霉卵孢子DNA的灵敏度检测
将浓度为100个卵孢子/ μ 1按10倍的梯度稀释到1个卵孢子/ μ 1，分别以1 μ 1各个浓度的DNA为模板进行引物TrapFl/TrapRl的PCR扩增。结果显示，在25 μ 1反应体系中含有1个卵孢子的DNA量时可检测到特异性的扩增条带。
[0029]3、大豆疫霉游动孢子DNA的灵敏度检测
将浓度为1000个游动孢子/ μ 1按10倍的梯度稀释到1个游动孢子/ μ 1，分别以1 μ 1各个浓度的DNA为模板进行单轮PCR扩增。结果显示，在25 μ 1反应体系中含有1个游动孢子的DNA量时可检测到特异性的扩增条带。
[0030]感病大豆植株的PCR检测:以NaOH裂解法提取接种大豆疫霉的大豆植株的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。结果是接种大豆疫霉的大豆植株接种点附近组织均能扩增出267bp条带，而健康植株只能以真核生物ITS区通用引物ITS1/ITS4扩增出一 700bp的条带，而用TrapFl/TrapRl扩增无条带出现。表明NaOH法及特异引物TrapFl/TrapRl可用于感病大豆植株的快速PCR检测。
[0031]土壤中病原物的检测:采用套式PCR检测采自不同地区田间的病土中的病原物，所有采自大豆病田的土样均扩增到了与阳性对照相同大小的条带，而作为阴性对照的土样则没有扩增出任何条带，说明采自这些病田的土样含有P.sojae。采用大豆叶片诱捕法的结果也证实了本发明人的PCR扩增结果。所有PCR扩增呈阳性的土样采用叶碟诱捕法均诱出了大豆疫霉，而作为阴性对照的土样则没有诱出，证明本发明设计的特异引物可以用来检测土壤中是否携带大豆疫霉。
[0032]本发明结构简单、操作简单，实用性好，用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具有重要的实际应用价值，大大提高了检测效率，准确性高，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR扩增的高灵敏度，从而可以有效地从每克含有一个卵孢子的土壤中检测出卵孢子，
灵敏度高。
[0033]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
【主权项】
1.一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10XPCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KC1溶液、1 % BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.4所述。2.一种如权利要求1所述的用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，所述套式PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应； (2)第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第一轮PCR 反应的 PCR 扩增程序为 92-96 °C变性 4_6min，92-96 °C 变性 0.5-1.5min ;50_70°C 退火20-40s ;68-76°C延伸 0.5-1.5min ；35 个循环，最后 68-76。。延伸 lOmin ； (3)第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR 反应的 PCR 扩增程序为 94-98 °C变性 3_5min，94-98 °C 变性 0.5-1.5min ;55_75°C 退火20-40s ;68-76°C延伸 0.5-1.5min ；37 个循环，最后 68-76。。延伸 lOmin ； (4)取第二轮PCR反应的扩增产物进行检测，若存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。3.根据权利要求2所述的用于检测大豆疫霉的试剂盒的检测方法，其特征在于，PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测大豆疫霉的试剂盒，包括用于检测大豆疫霉的引物、4种dNTP、10×PCR反应缓冲液、2mM的Mg2+、Tris.Cl溶液、KCl溶液、1％BSA和Taq酶，所述用于检测大豆疫霉的引物包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。本发明结构简单、操作简单，实用性好，用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具有重要的实际应用价值，大大提高了检测效率，准确性高，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR扩增的高灵敏度，从而可以有效地从每克含有一个卵孢子的土壤中检测出卵孢子，灵敏度高。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105316411
【申请号】CN201510774995
【发明人】赵春城, 李秀秀, 丁霜霜, 徐静, 李俊丽, 单金莲
【申请人】无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月13日