性内切酶SmaI和SacI位 点之间，如图1所示构建的植物表达载体命名为pTFlOl. 1-ubi-FLAc，其核巧酸序列为SEQ ID NO :3。
[0049]其中：
[0050] 2XP35S启动子，630bp，来自花挪菜花叶病毒CaMV，负责启动bar基因的表达；
[0051] TEV增强子，23化P，来自烟草蚀纹病毒，负责增强bar基因的表达。
[0052]bar选择标记基因，552bp，编码171个氨基酸，来自吸水链霉菌，编码草锭麟乙酷 转移酶，该酶通过乙酷化使草锭麟脱毒成为一种无活性的化合物，从而避免了对植物造成 伤害。转bar基因的供体生物表现出对除草剂草锭麟的抗性。
[0053]Tvsp终止子，654bp，来自大豆胆藏蛋白基因，负责终止bar基因转录。
[0054] ubi启动子，198化P，来自玉米基因组ubi基因，负责启动FLAc基因表达。 阳化5] FLAc基因，3558bp，编码1185个氨基酸，为本发明中所述的重组抗虫基因。转FLAc 基因的供体生物表现出对鱗翅目昆虫的抗性。
[0056] 化OS终止子，253bp，为根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区姻脂碱合成酶基因终止子，终 止FLAc基因转录。
[0057] 实施例3转FLAc基因玉米植株的获得
[0058] 本实验采用农杆菌介导的玉米遗传转化法，具体方法如下：
[0059] 1、含有pTFlOl. 1-ubi-FLAc的农杆菌EHA105在YEP固体培养基上涂布，28°C下暗 培养1~3d。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调0〇55。至0. 3,制成侵染液。 W60] 2、取授粉9~12d的玉米化II幼穗，剥取幼胚于侵染液中浸染5min。侵染结束后， 幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20°C暗培养3d，再转至静息培养基中，28°C暗培养7d。
[0061] 3、将正常发育的幼胚转至含有1. 5mg/L双丙氨麟的选择培养基I中，28°C暗培养 2周。将诱导的初始愈伤组织转至含有3mg/L双丙氨麟的筛选培养基II中，28 °C暗培养2 周，W后每两周更换一次筛选培养基II。
[0062] 4、当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径2cm左右时，将其转至暗分化培养基 上，25Γ暗培养2~3周。将分化得到的胚芽銷转至光分化培养基上，25Γ光下培养2周。 待胚芽銷形成完整的茎、叶和根，将植株转入培养瓶中促根壮苗lOd。
[0063] 5、将植株移栽入营养鉢，人工气候室中培养。待植株长出1~2片新叶后移入大 花盆，转移至溫室。 W64] 6、当植株生长至4-6叶期，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，转基因植 株开花后套袋授粉自交结实。种子播种在大田，植株长至4-6叶期是取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。 阳0化]如图2所示，PCR检测结果表明，FLAc基因已经转移并整合入植物基因组中，获得 了转FLAc基因玉米植株。
[0066] 表1 :PCR鉴定中所用引物及反应条件
[0067]
[0068] 实施例4检测FLAc基因在转化植物中的表达 W例采用Bt-化ylAb/Ac免疫检测试纸条检测FLAc基因的表达情况。
[0070] Bt-化ylAb/Ac免疫检测试纸条的使用方法：
[0071] 1、取约0.3g新鲜幼嫩叶片放在2ml的离屯、管中。然后将放有叶子的管插在冰盒 中，W保持新鲜度。 阳072] 2、取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500化-1血 SEB4样品提取缓冲液。
[0073] 3、取出检测条，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂 直，将末端插入至离屯、管中。插入部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持插入状态。
[0074] 4、3-5分钟内出现反应条带（图3)
[00巧]阳性结果：在检测条上出现两条灰色条带（方格内），一条检测线和一条质控线。
[0076] 阴性结果：在检测条上仅出现一条灰色质控线（方格内）。
[0077] 试纸条检测结果表明，FLAc基因在转FLAc基因玉米植株中得到了表达。
[007引实施例5转FLAc基因玉米植株拔节期叶片室内抗虫性鉴定
[00巧]拔节期取叶片分别放入不同平皿中，每个平皿接5只初解玉米惧幼虫，3次重复。 接虫4天后观察叶片损伤情况。
[0080] 结果如图4所示：非转基因植株叶片被玉米惧蛙蚀出很多虫孔，表现为感虫；转 FLAc玉米植株叶片没有虫孔，表现为抗虫。
[0081] 实施例6转FLAc基因玉米植株吐丝期花丝抗虫性鉴定
[0082] 抽丝期取非转基因玉米植株、转FLAc玉米植株花丝分别放入不同平皿中，每个平 皿接5只初解玉米惧幼虫，3次重复。接虫4天后观察花丝损伤情况。
[0083] 结果如图5所示：非转基因植株花丝已全部吃光，只剩深褐色的粪便和废屑，表现 为感虫；转FLAc基因植株花丝损害相对较小，表现为抗虫。
【主权项】
1. 一种人工合成的BT抗虫基因FLAc，其特征在于，其核苷酸序列为： 1) 序列如SEQIDNO. 1所示的DNA分子；或 2. SEQIDNO. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸所得的DNA 分子;或 3) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能多肽的核苷酸序列。2. 权利要求1所述抗虫基因FLAc的编码蛋白。3. 根据权利要求2所述的编码蛋白，其特征在于，所述的编码蛋白为如下氨基酸序列 之一的蛋白： a) 序列如SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能由序列SEQIDNO. 2衍生的蛋白质。4. 含有权利要求1所述抗虫基因FLAc的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体具体为 pTFlOl.l-ubi-FLAc-2X35S-bar〇6. 权利要求1所述抗虫基因FLAc或权利要求4所述重组载体在培育抗虫转基因植物 中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过将所述抗虫基因FLAc或重组表达载 体导入目的植物中，得到抗虫性高于所述目的植物的转基因植物。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植 物，所述的单子叶植物为玉米。9. 一种培育抗虫能力植物的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将所述的FLAc基因可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成含SEQIDNO:1所 示核苷酸序列的重组载体； 2) 将重组载体转入植物细胞； 3) 经筛选获得转化细胞，然后将转化细胞培育成转基因抗虫能力植株及其后代，所述 后代包括植物种子及植物组织。
【专利摘要】本发明公开了一种人工合成的BT抗虫基因FLAc及其应用，其核苷酸序列为：1)序列如SEQ？ID？NO.1所示的DNA分子；或2)SEQ？ID？NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸所得的DNA分子；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能多肽的核苷酸序列。本发明抗虫基因FLAc已报道的Cry基因最大同源性为77％，在拔节期、吐丝期高密度人工接玉米螟均显现出突出的抗玉米螟虫活性，为抗虫性基因的推广及商业化奠定基础。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/32, C07K14/325, C12N15/82, C12N5/10
【公开号】CN105331620
【申请号】CN201510736628
【发明人】郝东云, 韩四平, 尹悦佳, 李楠, 贺红霞, 刘相国, 刘洋, 柳青, 闫玮玉, 王阳
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月4日