一种单管高通量测序文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测生物技术领域，具体设及一种单管高通量测序文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在 人们对基因的结构W及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生 的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶 酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公 司人类遗传学研究室Mul1iS等创立并随后迅速发展起来的DNA体外扩增技术（Polymerase 化ainReaction,PCR)，W及90年代发展起来的DM忍片技术值ΝΑ化ip)，又将分子生物学 诊断技术提高到一个崭新的阶段。
[0003]大部分分子诊断实验室的核屯、技术都主要集中在检测特异性、相对较短的DNA或RNA片段上。随着医学研究的深入，越来越多疾病的发生机制与相关基因的变异有关，如 遗传性疾病β-地中海贫血与基因缺失相关，遗传性耳聋与GJB2、SLC26A4和线粒体DNA A1555G和C1494T突变相关，苯丙酬尿症在中国人群中已发现了 70种W上基因突变，家族遗 传性乳腺癌与BRCA1/2基因突变相关等等。因此与疾病相关的基因突变呈现多基因、多种 变异类型（点突变，插入，缺失）。临床迫切需要一种能够同时检测多基因、多变异位点的方 法。
[0004] 世界各国高度重视分子诊断技术的发展，高通量测序成为新一代分子诊断试剂开 发的主流。高通量测序是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合了多种现 代高精尖技术。高通量测序具有同时能够检测多个祀点的功能，具有快速有效的特点。因 而高通量测序成为新一代分子诊断试剂的主要开发方向。
[0005] 现有高通量测序文库构建方法主要分为两种：一种是Ampliseq技术，即利用多重 PCR技术多祀序列进行扩增，扩增产物纯化，通过DNA连接酶将特定序列连接至扩增产物两 端，再次纯化并进行扩增。该缺点是操作步骤多，文库构建时间久，约需要8个小时。另一 种是通过探针捕获技术，即将样本DNA进行打断，筛选出目标长度大小，利用带有标记的探 针进行杂交，使用带标记的磁珠与标记的探针结合，洗脱捕获所有目标序列，后进行特异序 列的连接并扩增。该方法缺点是杂交效率低，文库构建时间久约需要24小时。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种单管高通量测序文库的构建方 法。
[0007] 本发明的具体技术方案如下：
[0008]-种单管高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：
[0009] (1)针对若干目的基因分别设计若干对基本扩增引物，在基本扩增引物的正向引 物和反向引物的5'端均连接2~5个T，并在该2~5个T的靠近3'端的第一个T上进 行PM修饰，与目的基因无关，既不影响起始PCR扩增反应的效率，也不会造成引物对之间 的非特异性扩增，使得扩增产物能够产生粘性末端，该若干对基本扩增引物的Tm值相差不 超过rC，相应的退火溫度为56~64°C;
[0010] (2)设计一对不对称连接探针和一不与人类基因组形成互补的通用引物，该对不 对称连接探针包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从 3'端至5'端均依次包括一能够与不对称连接探针的5'端若干连续碱基配对的互补序列、 一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2~5个T相对应的粘性末端识别序 列，上述正向探针和反向探针的Tm值相差不超过rC，且上述正向探针和反向探针自身形 成环状的退火溫度与基本扩增引物的退火溫度相差不超过rc;
[0011] (3)将模板、上述若干对基本扩增引物、不对称探针、通用引物置于一含有DM连 接酶和DNA末端修饰酶的PCR反应体系中进行扩增，得扩增产物，该扩增的程序的时间为 2~化，并依次包括：预变性、第一阶段扩增和第二阶段扩增，其中第一阶段扩增依次包括 第一变性阶段、第一退火阶段和第一延伸循环阶段，第一延伸循环阶段的循环数为5~15， 第一退火阶段的退火溫度为60~65°C，第二阶段扩增依次包括第二变性阶段、第二退火阶 段和第二延伸循环阶段，第二延伸循环阶段的循环数为15~30 (优选为20);第一退火阶 段的退火溫度比第二退火阶段的退火溫度高4~8°C;由于每一循环的产物可W作为下一 个循环的模板，经过第一阶段扩增之后，本发明设计的基本扩增引物所扩增的产物得到大 量的积累，运些积累的产物又重新作为第二阶段扩增的模板，此时通用引物能够与运些模 板完全匹配，结合效率大幅度提升；
[0012] (4)将扩增产物纯化后，即得所述高通量测序文库。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述互补序列和扩增序列之间还设有一标记序 列，用W对不同样本进行识别。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述标记序列的长度为10~15bp。
[0015] 在本发明的一个优选实施方案中，所述互补序列的长度为3~化P。
[0016] 在本发明的一个优选实施方案中，所述通用引物的长度为10~15bp。
[0017] 在本发明的一个优选实施方案中，所述不对称连接探针的正向探针和反向探针的 长度均不大于50bp。
[0018] 在本发明的一个优选实施方案中，所述DM连接酶为T4DNA连接酶。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] (1)本发明的单管高通量测序文库的构建方法针对多个祀序列进行单管，快速完 成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2~3小时，手动时间仅仅需要15~30分钟即可， 结合高通量测序平台可W十分有效的解决目前对于临床上肿瘤、遗传病等疾病中在少量的 临床样本基础上需要对体细胞多基因、多祀点检测运一难点，且成本低廉；
[0021] (2)本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检 巧。，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量 测序平台、基因忍片平台、杂交检测平台。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的第一阶段扩增和第二阶段扩增的示意图；
[0023] 图2为本发明实施例1的高通量测序忍片总的Reads数量
[0024] 图3为本发明实施例1的3个样本分别Reads数量和平均长度
[0025] 图4为本发明实施例1的样本数据与目标序列的匹配度
[0026]图5为本发明实施例1的每个样本的匹配度和均一性
【具体实施方式】
[0027]W下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。 [002引如图1所示，本发明的技术方案为：
[0029] 一种单管高通量测序文库的构建方法，包括如下步骤：
[0030] (1)针对若干目的基因分别设计若干对基本扩增引物，在基本扩增引物的正向引 物F1和反向引物R1的5'端均连接2~5个T10,并在该2~5个T10的靠近3'端的第 一个T上进行PNA修饰，该若干对基本扩增引物的Tm值相差不超过rC，相应的退火溫度为 56 ~64Γ;
[0031] (2)设计一对不对称连接探针和一不与人类基因组形成互补的通用引物F3,该对 不对称连接探针包括可自身形成环状的一正向探针F2和一反向探针R2,该正向探针F2和 反向探针R2从3'端至5'端均依次包括一能够与不对称连接探针的5'端若干连续碱基配 对的互补序列11、一标记序列化arcode) 12、一与所述通用引物F3互补配对的扩增序列13 和一与上述2~5个T相对应的粘性末端识别序列14,上述正向探针F2和反向探针R2的 Tm值相差不超过rC，且上述正向探针F2和反向探针自身形成环状的退火溫度与基本扩增 引物的退火溫度相差不超过rc;
[0032] (3)将模板、上述若干对基本扩增引物F1和R1、不对称探针F2和R2、通用引物F3 置于一含有DNA连接酶和DNA末端修饰酶的PCR反应体系中进行扩增，得扩增产物，该扩增 的程序的时间为2~化，并依次包括：预变性、第一阶段扩增和第二阶段扩增，其中第一阶 段扩增依次包括第一变性阶段、第一退火阶段和第一延伸循环阶段，第一延伸循环阶段的 循环数为5~15,第一退火阶段的退火溫度为60~65°C，第二阶段扩增依次包括第二变性 阶段、第二退火阶段和第二延伸循环阶段，第二延伸循环阶段的循环数为15~30;第一退 火阶段的退火溫度比第二退火阶段的退火溫度高4~8°C;
[003引 （4)将扩增产物纯化后，即得所述高通量测序文库。
[0034] 本领域技术人员可知，本发明的参数在下述范围内变化时仍能够取得与下述实施 例相同或相近的技术效果：
[0035] 所述标记序列的长度为10~15bp。
[0036] 所述互补序列的长度为3~化P。
[0037] 所述通用引物F3的长度为10~15bp。