反应体系：总体积20ul
[0028] 模版DNA:lul
[0029] 引物Hexon A/Hexon B :0. 5ul/0. 5ul
[0030] 2XPremixTaq：10ul
[0031] 4d水：Sul [00础PCR反应条件：
[0033]
[0034]
[0035] 经扩增，分离毒株扩增出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。结果详 见图1 :
[0036] 根据化χοη基因序列比对和遗传进化分析结果可W看出，分离毒与I群禽腺病毒 属于同一分支，与血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差异；与血清6型、7型、8a和 8b型同源性更低。详见图2、图3。
[0037] 3. 5动物回归试验将分离毒株接种10只40日龄SPF鸡（编号1~10号），每只 肌肉注射0. 1ml，连续观察10日并进行剖检，记录结果。取死亡鸡肝脏用10%福尔马林固 定制备组织切片观察组织学病变；并固定并按照负染色方法固定、染色，电镜下观察。结果： 分离毒引起试验维鸡10/10发病，8/10死亡。临床症状主要表现为精神沉郁，食欲不振， 闭眼嗜睡、蹲伏、甚至死亡；经剖检可见屯、包积水，肝脏肿大，边缘有黄白色坏死斑，或表面 有不同程度的出血点和出血斑，肝脏稱色呈淡褐色至黄色，质脆；肾脏肿大出血。鸡肝脏组 织切片光镜下可观察到肝细胞核内包涵体；电镜下可观察到鸡肝细胞核中有大量腺病毒粒 子，有些病毒粒子呈晶格状排列。
[0038] 结果显示，分离到一株毒力较强的I群4型禽腺病毒。
[0039] 4病毒继代挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1 %毒种（YBAV-4 株原始毒种第3代）的维持液，置37Γ培养36~48小时，当细胞病变达80%W上时收获， 冻融2次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。按此方法连传 15化分别标记为C4~C18代。
[0040] 实施例2I群4型禽腺病毒YBAV-4株的毒力测定
[0041] 1致细胞病变（CP巧作用将病毒含量不低于l(f°TCIDw/0. 1ml的各代次毒种，按 0. 5%的量接种于长势良好的鸡肝细胞，置37°C培养36~48小时，观察细胞病变情况。结 果均出现细胞圆缩等特异性病变。
[0042] 2病毒含量测定将上述各代毒种，用细胞维持液进行10倍系列稀释，取1〇-6、1〇-7、10-S3个稀释度，分别接种于长势良好的鸡肝细胞（96孔细胞板），每个稀释度接种6孔， 每孔0. 1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37°C、5%C〇2培养箱培养和观察 168小时，出现CPE者判为感染，计算TCI^。。测定结果表明，YBAV-4株第C4~C18代毒种 的病毒含量在 1〇7'31 ~l〇s'°°TCIDw/0. 1ml。
[0043] 3对维鸡的毒力将C4、C7、CIO、C15、C18代毒种，分别用灭菌生理盐水或PBS稀释 至105'5TCIDsc/0. 1ml，肌肉注射42~56日龄SPF鸡10只，每只0. 2ml。观察并记录发病情 况。结果：试验鸡攻毒后3~5日发病，发病后1~2日多数死亡，攻毒后7日内不发病的 鸡W后不再发病，攻毒后发病但7日内不死亡的鸡逐渐康复，发病死亡鸡及处于发病期间 的鸡于攻毒后7日剖检有典型的屯、包积水及肝脏或肾脏肿大病变。攻毒后7日内发病率均 不少于9/10,死亡率均不少于7/10。详见表1。
[0044] 表1YBAV-4株各代次毒种对维鸡的毒力
[0045]
[0046] 实施例3I群4型禽腺病毒YBAV-4株的免疫原性评价
[0047] 将C4、CIO、C15、C18代毒种，分别接种鸡肝细胞繁殖，取病毒含量 > 107'°TCIDw/0. 1ml的病毒液，灭活后W1:2(水相：油相）的比例制成灭活疫化取21~ 28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗，每只0. 3ml，另10只不免疫作 对照。接种后21~28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射I群4型禽腺病毒YBAV-4株病 毒液（约含1〇5'5TCIDw/0. 1ml)，每只0. 2ml。观察14日，记录发病情况。结果：免疫组鸡观 察14日，攻毒保护率为9/10~10/10 ;对照组鸡攻毒后7日内发病率为9/10~10/10,死 亡率7/10~8/10,7日后均未见新增发病。说明毒种在18代W内免疫原性稳定。详见表 2。
[004引表2YBAV-4株各代次毒种免疫原性测定
[0049]
[0050] 实施例4I群4型禽腺病毒YBAV-4株的特异性评价
[0051] 将C4、C10、C15、C18代毒种，分别用细胞维持液稀释至200TCID5d/0. 1ml，与等量抗 I群4型禽腺病毒特异性血清混合，在室溫中和1小时后，接种长势良好的鸡肝细胞（24孔 细胞板）4孔，每孔0. 2ml，补充维持液至2. 0ml;同时设未中和的病毒液4孔作阳性对照，正 常细胞2孔作阴性对照，置37°C、5%C〇2培养箱培养和观察168小时，记录细胞病变孔数。 详见表3。
[0052] 表3YBAV-4株各代次毒种的特异性测定
[0053]
[0054] 实施例5I群4型禽腺病毒YBAV-4株灭活疫苗安全性试验
[005引用21~28日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1. 0ml(颈后部两侧皮 下各注射0.5ml)，观察14日，观察是否出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0056] 试验结果：所有接种鸡均未有异常的临床反应和病理变化。灭活后加油佐剂的I 群4型禽腺病毒YBAV-4株对接种鸡是安全的，不会造成任何的局部或全身反应。
[0057] 实施例6I群4型禽腺病毒YBAV-4株灭活疫苗免疫保护性试验
[005引 1取21~28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只 作对照。接种后21~28日，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测I群4型禽腺病 毒抗体，记录抗体结果。
[0059] 2取21~28日龄SPF鸡20只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只 作对照。接种后21~28日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射I群4型禽腺病毒YBAV-4株 病毒液（约含105'5TCIDw/0. 1ml)，每只0. 2ml。观察并详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情 况。
[0060] 试验结果：琼扩试验检测I群4型禽腺病毒抗体，免疫组至少8只阳性，对照组全 部阴性。对照鸡攻毒后7日内发病至少8只，免疫鸡攻毒后观察14日，保护至少8只。显 示该毒株具有良好的免疫保护效果。
[0061] 实施例7I群4型禽腺病毒YBAV-4株稳定抗原的制备及稳定性试验
[0062] 将I群4型禽腺病毒YBAV-4株接种鸡肝细胞培养，收获细胞培养物，经甲醒溶液 灭活后，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成。该抗原在使用和储备时不存在散毒的危险， 减少了因为使用活病毒抗原而对环境和人体的危害，该产品具有很好的稳定性，在2~8°C 条件下，保存12个月W上该产品效价不变，可用于I群4型禽腺病毒琼扩抗体的检测。
[0063] 而且，用YBAV-4株制备的毒病灭活疫苗对于YBAV-4株的攻毒的免疫效果明显好 于市售的I群4型禽腺病毒疫苗，推测是由于YBAV-4株基因发生变异导致的。
[0064] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种I群4型禽腺病毒，其特征在于，所述的病毒的保藏编号为：CCTCCNo.V 201541ο2. 权利要求1所述的病毒在制备疫苗中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。4. 权利要求1所述的病毒在制备I群4型禽腺病毒检测用的琼扩抗原试剂中的应用。5. 权利要求1所述的病毒在制备I群4型禽腺病毒检测用阳性血清试剂中的应用。6. 权利要求1所述的病毒在制备I群4型禽腺病毒治疗用抗血清试剂中的应用。
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种Ⅰ群4型禽腺病毒毒株，其保藏编号为CCTCC？No.V？201541。本发明的Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株具有良好的特异性和免疫原性，感染细胞液与抗减蛋综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、禽流感等特异性阳性血清鸡SPF鸡血清均不出现特异性沉淀线，而能与抗Ⅰ群4型禽腺病毒特异性血清出现明显的特异性沉淀线。本发明作为制造效果良好的疫苗毒株，预防鸡心包积水肝炎综合征，用于病毒血清型的鉴定和流行病学的调查。CCTCC No.V 20154120151015
【IPC分类】A61P31/20, G01N33/569, A61K39/235, C12N7/00, C12R1/93
【公开号】CN105368795
【申请号】CN201510932710
【发明人】王红, 申茂欣, 张恒, 韩建文, 李陆梅, 刘红祥, 党启峰, 范根成, 杜元钊
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月14日