包含修饰铰链区的IgG4FC片段的制作方法

包含修饰铰链区的IgG4FC片段的制作方法
【专利说明】包含修饰铰链区的lgG4FC片段
[技术领域]
[0001] 本发明涉及可用作药物载体的IgG4Fc片段，更具体地涉及可以最小化Fc的效应 子功能（effector functions)，但不引起与体内IgG进行链交换，并且可以提高缀合药物 的体内半衰期的IgG4Fc片段。
[【背景技术】]
[0002] 遗传工程技术的进步已经造就各种蛋白质药物的制造和使用。但是，蛋白质药物 的致命问题在于，其因体内蛋白酶而容易变性或容易分解，因此无法长时间维持其体内浓 度和滴定度。因此，为了给患者提供有效治疗同时减少患者接受通过注射等进行的频繁蛋 白质供应的负担和其费用，通过增加蛋白质稳定性使蛋白质药物的血液和体内浓度维持在 适当水平是非常重要的。
[0003] 因此，为提高蛋白质药物的体内稳定性，长久以来已做过很多尝试一一通过改变 蛋白质的制剂类型、与其它蛋白质融合、或通过化学或生物学方法将合适的聚合物附着于 蛋白质表面上。
[0004] 其中一种通过与其它蛋白质融合来提高蛋白质稳定性的尝试是进行免疫球蛋白 Fc和蛋白质之间的融合。
[0005] Fc区，除抗原结合能力（免疫球蛋白的主要功能）之外，还负责效应子功能，如补 体依赖性细胞毒性（CDC)和抗体依赖性细胞毒性（ADCC)。此外，存在于Fc区的FcRn序列 具有通过缀合至体内FcRn受体来增加体内半衰期而调节血清中的IgG水平的作用。关于 这点，已经通过Fc区与治疗性蛋白质之间的融合进行了积极的研究来改良治疗性蛋白质。
[0006] 但是，通过遗传重组产生的Fc融合蛋白的缺点在于：蛋白质融合仅在Fc区的特定 区域可能发生，即氨基末端或羧基末端，且仅在糖基化蛋白质之间或非糖基化蛋白质之间 可能发生，但在糖基化蛋白质和非糖基化蛋白质之间不可能发生。此外，通过遗传重组产生 的Fc融合蛋白的问题在于：由于通过融合新产生的氨基酸序列可导致免疫应答发生，以及 蛋白酶对连接体区域的敏感性可能增加。
[0007] 此外，Fc融合蛋白具有增强的靶蛋白血清半衰期，但同时其也存在问题：Fc区具 有的效应子功能显现（美国专利号5, 349, 053)。通过Fc区的效应子功能，融合蛋白可以固 着补体或结合至FcRs表达细胞以破坏特定细胞，和诱导引发炎症的多种细胞因子生成和 分泌，从而引发炎症。另外，融合区域中的蛋白质序列是在人体中不存在的新蛋白质序列， 因此其具有多种缺点，包括在长期施用的情况下可能诱导免疫应答。
[0008] 因此，研究已致力于采用其中效应物功能被删除同时血清半衰期得到保持的免疫 球蛋白或免疫球蛋白片段。Cole等先前报道，通过用丙氨酸取代CH2结构域中的第234、235 和237位残基（已知其在结合Fc受体方面具有重要作用）来抑制ADCC活性，以生产Fc受 体亲和力降低的Fc衍生物，（Cole等，J. Immunol. 159 :3613-3621，1997)。但是，所有的这 些都具有不适合的、与天然人Fc区不同的氨基酸，因此可具有更高的免疫性或抗原性，并 且优选的Fc功能可能丧失。
[0009] 作为在保持高血浓度免疫球蛋白的同时去除或减少不需要的效应子功能的方法， 一种去除免疫球蛋白中的糖类的方法得到研究。在美国专利号5, 585, 097中，通过在制备 CD3抗体时使CH2结构域的第297位天冬酰胺残基（CD3抗体的糖基化残基）被另一氨基酸 取代，制备了非糖基化的抗体衍生物，并且具体地，该衍生物显示出降低的效应子功能，同 时保持与FcRn受体的结合力，并且不改变其血清半衰期。但是，该方法也存在问题，由于新 的重组构建体生成，其可能被免疫系统识别为外来物质并因此被免疫系统排斥。
[0010] 在利用天然IgG Fc的序列制备融合蛋白质时，可选择IgG4Fc，以最小化Fc的效 应子功能。已知IgG4具有与IgGl相似的体内半衰期，但由于氨基酸序列差异而具有相对 小的效应子功能。然而，尽管IgG4具有效应子功能降低的优势，但由于其独特的铰链序 列，IgG4之间可发生体内链交换，因此据报道，将融合蛋白质用于治疗目的时存在很大困 难（van der Neut Kolfschoten 等，Science, 317:1554-1557, 2007)。也就是说，存在如下 问题：当IgG4Fc被用作蛋白质融合的载体时，与体内存在的IgG4发生链交换，从而与天然 IgG4形成杂合体，或者其可以单体形式存在，从而改变原始结构并具有低治疗活性的结构。 通过遗传工程或在体外是否生成IgG4Fc片段和生理活性物质之间的融合产物是一个普遍 问题。
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【发明内容】
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[0011] [技术问题]
[0012] 在这种情况下，基于研发能够充当药物载体的、诱导与体内IgG的Fab臂交换反应 (exchange反应）和效应子功能的风险低、同时能够克服遗传重组融合技术的缺点的IgG Fc片段的研究，发明人发现，当在大肠杆菌（E. coli)中生成经突变仅具有一个半胱氨酸残 基的IgG4Fc片段铰链序列并使之与药物缀合时，可形成具有耐久性提高而无诱导与体内 IgG的Fab臂交换反应和效应子功能的风险的药物缀合物，从而完成本发明。
[0013] [技术方案]
[0014] 本发明的一个目的是提供IgG4Fc片段，其诱导与体内IgG的链交换反应或效应子 功能的风险低，并且可以充当药物载体。更具体地，本发明的一个目的是提供修饰的IgG4Fc 片段，其包含修饰的铰链区，其中部分铰链序列被删除，而仅包括一个半胱氨酸残基。.
[0015] 本发明的另一目的是提供核酸，其编码包含修饰铰链区的修饰IgG4Fc片段，其中 部分铰链序列被删除，从而仅包括一个半胱氨酸残基。
[0016] 本发明的又一目的是提供载体，其包含编码包含修饰铰链区的修饰IgG4Fc片段 的核酸，其中部分铰链序列被删除，从而仅包括一个半胱氨酸残基。
[0017] 本发明的又一目的是提供微生物，该微生物其中引入包括编码包含修饰铰链区的 修饰IgG4Fc片段的核酸的载体，其中部分铰链序列被删除，从而仅包括一个半胱氨酸残 基。
[0018] 本发明的又一目的是提供制备修饰IgG4Fc片段的方法，包括培养引入了载体的 微生物，所述载体包括编码修饰IgG4Fc片段的核酸。
[0019] 本发明的又一目的是提供药物缀合物，其中药物和修饰IgG4Fc片段通过连接体 缀合。
[0020] 本发明的又一目的是提供包含药物缀合物的药物组合物，其中药物和修饰IgG4Fc 片段通过连接体缀合。
[0021] [发明的有利效果]
[0022] 本发明可提供修饰的IgG4Fc片段，其在没有氨基酸取代或添加或聚糖添加的情 况下具有最小化的效应子功能，并且与体内IgG4无链交换反应。本发明的修饰IgG4Fc片 段与其缀合至药物的方法（如遗传工程法和体外共价法）无关，在其缀合至药物时，可抑制 缀合药物的体内链交换反应，因此与天然IgG4Fc片段相比，可以提供显著的治疗优越性。
[0023] [附图简述]
[0024] 图1显示大鼠血液中是否存在生物素化hIgG4和人粒细胞集落刺激因 子-PEG-IgG4Fc片段之间的人IgG4链交换。
[0025] 图2显示人血液中是否存在生物素化hIgG4和人粒细胞集落刺激因 子-PEG-IgG4Fc片段之间的人IgG4链交换。
[0026][最佳实施方式]
[0027] 下面将参考附图对本发明的优选实施方式进行更加详细的描述。但是，本发明可 以不同形式实施，不应被解释为限制于本文所示的实施方式。相反，这些实施方式被提供， 使得本公开是透彻而完整的，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。
[0028] 在实现上述目的的方面，本发明提供可用作药物载体的修饰IgG4Fc片段。更具体 地，本发明提供包含修饰铰链区的修饰IgG4Fc片段，其中部分铰链序列被删除，从而仅包 括一个半胱氨酸残基。
[0029] 本发明的修饰IgG4Fc片段包括修饰铰链区，其中由下列氨基酸序列表示的铰链 区部分被删除，从而仅包括一个半胱氨酸残基：
[0030] Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID N0：1).
[0031] 在争取解决IgG4Fc片段由于与体内IgG4的链交换反应而具有低效用的问题时， 尽管其作为载体增加药物半衰期的效用，本发明人发现，当通过删除从IgG4Fc片段的铰链 区中存在的两个半胱氨酸残基中去除一个半胱氨酸残基以及部分铰链区来修饰IgG4Fc片 段时，不发生体内链交换反应和单体形成，从而确认修饰的IgG4Fc片段可以有效地用作药 物载体。
[0032] 在实施方式中，本发明的IgG4Fc片段可包括修饰的铰链区，所述修饰通过删除 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位Cys残基的1至8个氨基酸进行。
[0033] 另外，在实施方式中，本发明的IgG4Fc片段可包括修饰的铰链区，所述修饰通过 删除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位Cys残基的1至8个氨基酸进行。
[0034] 可选地，在实施方式中，本发明的IgG4Fc片段可包括修饰的铰链区，所述修饰通 过删除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位Cys残基的1至5个氨基酸、或SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位Cys残基的1至5个氨基酸进行。
[0035] 可选地，在实施方式中，本发明的IgG4Fc片段可包括修饰的铰链区，所述修饰通 过删除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位半胱氨酸残基的1至3个氨基酸、或SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位半胱氨酸残基的1至3个氨基酸进行。
[0036] 以上删除的氨基酸残基可以是连续的或不连续的。
[0037] 本发明的IgG4Fc片段的铰链区的特征在于，其经修饰仅包括SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列的第8位和第11位的两个半胱氨酸残基之间的一个半胱氨酸残基，以及两个半胱氨 酸残基没都被去除。
[0038] 经修饰仅包括铰链区内的两个半胱氨酸残基中的一个半胱氨酸残基的铰链区使 修饰的IgG4Fc片段在无体内链交换、单体形成等的情况下具有效果。
[0039] 如本文所用，术语"载体"(carrier)是指缀合至药物以及正要缀合至药物的物质， 其通常增加或去除药物的生