用于差分检测的嵌入染料的制作方法
【专利说明】用于差分检测的嵌入染料
[0001 ]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求于2014年I月10日提交的美国临时申请61/926，172号的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
【背景技术】
[0003]可检测或定量核酸以搜索有用的基因、诊断疾病或鉴定生物体。设计为检测或定量核酸的分子方法可用于检测突变、检测稀有核酸、定量基因表达、测量RNA稳定性等。这类分子方法可用于确定核酸的相对比例。例如，分子方法可用于确定与样品中野生型核酸的丰度相比突变或多态性核酸的丰度。
[0004]用于检测或定量核酸的方法和组合物包括数字方法，其中样品被分为多个混合物划分产物并确定各划分产物中是否存在一种或多种感兴趣的核酸。在一些情况中，两种或多种检测试剂或探针被用于检测划分产物中两种或多种感兴趣的核酸。在这类情况中，探针或其他检测试剂的交叉反应性可使得难以明确地检测或定量感兴趣的核酸。例如，当一种感兴趣的核酸比另一种更普遍时，例如当一种核酸代表野生型序列且另一种代表突变时，检测试剂的交叉反应性可造成特别的困难。当一种感兴趣的核酸与另一种非常类似时，交叉反应性也可造成特别的困难。
【发明内容】
[0005]在一些实施方式中，本发明提供一种核酸序列检测方法，包括:提供包含DNA或RNA核酸的样品；将所述样品划分为一组混合物划分产物;使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。
[0006]在一些方面中，在检测前扩增核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。例如，该非特异性检测试剂是在扩增步骤期间掺入至一个或多个结构上不同的扩增子中的标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸，并检测一个或多个结构上不同的扩增子中掺入的标记物。
[0007]在一些方面中，该非特异性检测试剂是嵌入染料。例如，该嵌入染料可选自:EvaGreen、picogreen、溴化乙啶、SYBR Green KSYBR Go Id、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO 和BEBO。在一些方面中，该序列特异性检测试剂选自结构化探针(structured probe)和线性探针。在一些情况中，该结构化探针选自分子信标和蝎型探针(scorp1n probe)。在一些情况中，该线性探针选自杂交探针和水解探针。
[0008]在一些方面中，该非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物(或引物的混合物，如随机引物的混合物)。
[0009]在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该核酸是RNA，且该方法还包括逆转录该RNA核酸。
[0010]在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括扩增两种或多种潜在的扩增子。在一些方面中，在存在双链核酸的混合物划分产物中，潜在的扩增子之一的量为小于50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少。在一些情况中，该序列特异性检测试剂检测一种特异性扩增子，且该非序列特异性检测试剂检测任何扩增子。
[0011]在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该序列特异性检测试剂检测序列变体。在一些情况中，该序列变体是稀有序列变体。在一些情况中，双链核酸存在于多个混合物划分产物中，且该稀有序列变体存在于小于约50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少的混合物划分产物中。
[0012]在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定总核酸浓度，所述混合物划分产物中非特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定靶核酸序列浓度，所述混合物划分产物中序列特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括确定其中序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物与其中非序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物的比率，该比率表示样品中包含靶核酸的核酸比例。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。
[0013]在一个实施方式中，本发明提供一种核酸序列检测方法，包括:提供包含DNA或RNA核酸的样品，该D NA或RNA核酸包含第一革E标和第二革E标;将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及使用结合第一靶标(如果存在)的特异性检测试剂(如特异性检测第一靶标而非第二靶标)和结合并从而检测两种靶标(如果存在)的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的第一靶标和第二靶标;从而确定样品中第一靶标的浓度以及第一和第二靶标的浓度。
[0014]在一个方面中，该方法还包括在混合物划分产物中扩增这些靶标;检测包括检测第一和第二靶标的扩增;且该特异性检测试剂结合代表第一靶标的扩增子(例如特异性结合并从而检测第一靶标而非第二靶标的扩增子)且该非特异性检测试剂结合并从而检测代表第一和/或第二靶标的扩增子。
[0015]在一个方面中，该检测包括在至少一个混合物划分产物中确定是否存在第一靶标且确定是否存在第一或第二靶标。在一些情况中，对多种混合物划分产物进行检测。在一些情况中，该方法还包括确定包含第一靶标的混合物划分产物与包含第一或第二靶标的混合物划分产物的比率。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。
[0016]在一个方面中，该第一靶标是突变体或多态性且该第二靶标是野生型核苷酸序列。
[0017]在一个实施方式中，本发明提供了一种包含少于约10nL的混合物划分产物的组合物，其包含:包含DNA或RNA的核酸;非特异性检测试剂;和序列特异性检测试剂。在一个方面中，该组合物还包含扩增试剂。在一个方面中，该非特异性检测试剂选自:EvaGreen、溴化乙啶、SYBR Green KSYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、T0T0、B0XT0和ΒΕΒ0。该非特异性检测试剂可以是检测总双链核酸的引物。该非特异性检测试剂可以是标记的核苷三磷酸。该序列特异性检测试剂可选自分子信标、蝎型探针、杂交探针和水解探针。
[0018]在一个实施方式中，本发明提供了一组混合物划分产物，其中，多个混合物划分产物包含前述组合物之一。在一些情况中，该组包含至少约100、200、500或1000个混合物划分产物。在一些情况中，多个混合物划分产物包含双链核酸。在一些情况中，大多数包含双链核酸的混合物划分产物不包含靶核酸。在一些情况中，该靶核酸是序列变体。
[0019]附图简要说明
[0020]图1:描述了通过使用两种序列特异性探针的数字液滴PCR检测含有DNA分子群体的样品中稀有SNP的典型实验。其中未检测到野生型或稀有变体的液滴表示为“一”且归类在左下象限。其中仅检测到野生型核酸的液滴表示为且归类在右下象限。其中检测到野生型和稀有变体的液滴表示为“++”且归类在右上象限。其中仅检测到稀有变体的液滴表不为“_+”且归类在左上象限。
[0021]图2:描述了通过使用一种序列特异性探针和一种非特异性探针的数字液滴PCR检测含有DNA分子群体的样品中稀有SNP的实验。其中未检测到野生型或稀有变体的液滴表示为且归类在左下象限。其中仅检测到野生型核酸的液滴表示为且归类在右下象限。其中检测到野生型和稀有变体的液滴表示为“++”且归类在右上象限。其中仅检测到稀有变体的液滴表示为且也归类在右上象限。
[0022]定义
[0023]除非另外定义，本文中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICT1NARY OF CELLANDMOLECULAR B1LOGY(《细胞分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007) ; Sambrook等，MOLECULARCLONING,ALAB0RAT0RY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前时，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，且不对本发明的范围构成限制。
[0024]本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分为多个部分或多个“划分产物”。划分产物可以是固体或流体。在一些实施方式中，划分产物是固体划分产物，例如微米或纳米通道。在一些实施方式中，划分产物是流体划分产物，例如液滴。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物，或乳液。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在其它实施方式中，流体划分产物是与相邻水性液滴在物理或化学上分开的水性液滴，使得一个液滴中的核酸、缓冲剂、盐或其他分子不会扩散到相邻液滴中。
[0025]术语“检测试剂”指与靶分子相互作用或结合靶分子(如核酸)的分子(例如染料、蛋白质、核酸、适体等)。与靶分子相互作用或结合靶分子的分子的非限制性示例包括染料(如嵌入染料)、核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适体。
[0026]术语“序列特异性检测试剂”指特异性结合特定序列或特异性检测特定序列的分子(例如核酸、蛋白质、适体等)。在一些实施方式中，序列特异性检测试剂可与非靶核酸具有交叉反应性。
[0027]术语“特异性结合”或“与……特异性相互作用”指检测试剂(如寡核苷酸、适体或抗体)与靶序列的结合亲和力比一种或多种非靶序列高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。本文中，较高的亲和力可测量为例如较低的解离常数(Kd)。例如，特异性结合特定靶核酸的检测试剂将通常以与一种或多种非靶核酸相比高至少10倍的亲和力结合靶核酸(例如，Kd是与非靶核酸的Kd的1/10)。在一些情况中，该非靶核酸包括与靶核酸基本类似的核酸。例如，在一些情况中，该非靶核酸包括与靶核酸相差约I个核苷酸(例如相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的核酸。作为另一个示例，该非靶核酸可包括与靶核酸基本类似的保守区域或结构域和基本不同的其他区域或结构域。在一些方面中，该非靶核酸包括与靶核酸基本不同的核酸。在一些情况中，特异性结合特定靶核酸的检测试剂将与该靶核酸杂交，其解链温度比与非靶核酸杂交时的解链温度高至少0.5、1、2、5、10、15、20或25°(3。
[0028]在一些情况中，“特异性结合”或“与……特异性相互作用”指在复合混合物中结合并检测靶序列但基本不结合或检测非靶序列的检测试剂(如寡核苷酸、适体或抗体)。例如，特异性结合靶序列的检测试剂可不检测或基本不检测包含生物体或样品的基因组或转录组的细胞裂解物或核酸制备物中存在的非靶核酸。
[0029]术语“非特异性检测试剂”指结合或检测总体核酸(例如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的分子。例如，非特异性检测试剂可包括结合核酸的染料，如嵌入染料。或者，非特异性检测试剂可包括结合或检测掺入至核酸的通用序列的核苷酸。例如，可通过一种或多种含有可检测序列的引物来扩增样品中的核酸。该非特异性检测试剂可检测扩增反应期间纳入的可检测序列。在一些情况中，该非特异性检测试剂可区分经扩增和未扩增的核酸。在其他情况中，该非特异性检测试剂可区分单链和双链核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂可区分DNA和RNA。在一些情况中，该非特异性检测试剂在结合核酸时发荧光或增加荧光。
[0030]术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如32P、3H)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及