]藤
[0115]在一些实施方式中，在适用于使序列特异性检测试剂特异性结合特异性核酸序列和/或使非特异性检测试剂结合核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的条件下使样品与两种或更多种探针孵育后，洗涤样品以除去不特异性结合核酸的检测试剂。在一些实施方式中，将样品与第一检测试剂孵育，随后在将样品与第二检测试剂孵育前任选地经过洗涤条件。在一些实施方式中，对于两种、三种、四种、五种或更多种检测试剂，可依次将样品与检测试剂孵育，随后任选地将样品置于洗涤条件，随后将样品与不同的检测试剂孵育。
[0116]适当洗涤条件、洗涤缓冲液等的选择将基于诸如检测试剂、靶分子等的条件变化且可由本领域技术人员确定。例如，在一些实施方式中，其中检测试剂-核酸复合物比单独的检测试剂更密集，可通过离心洗涤样品以沉淀检测试剂-核酸复合物，随后重悬在缺少检测试剂的缓冲液中。作为另一个示例，在一些实施方式中，可使样品通过密度梯度或其他梯度(如通过电荷分离)以分离检测试剂-核酸复合物与未结合的检测试剂。作为另一个示例，在一些实施方式中，可使样品通过柱(如尺寸排阻柱)来洗涤检测试剂-核酸复合物以分离复合物与未结合的检测试剂。需要时，可重复洗涤过程以进行额外的洗涤。在一些实施方式中，在划分前洗涤样品。在一些实施方式中，在划分后洗涤样品。在一些实施方式中，在使样品与检测试剂孵育后和检测检测试剂前不进行间插的洗涤步骤。
[0117]在一些实施方式中，在划分样品之前、期间和/或之后，将样品维持在受控的温度或温度范围下。在一些实施方式中，在划分样品之前、期间和/或之后，将样品维持在约20°、25。、30。、35。、40。、45。、50。、55。、60。、65。、70。、75。、80。、85。、90° 或95°C的温度下，例如允许由一种或多种经标记探针所生成信号扩增的温度下。在一些情况中，在划分之前或之后循环样品温度。在一些情况中，温度循环提供检测试剂、标记物和/或靶核酸的扩增。
[0118]检遲
[0119]可使用多种检测装置中的任一种来检测检测试剂或可检测标记物。示例性检测方法包括放射性检测、光学检测(如吸光度、荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性示例，可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光团吸收)以及检测由荧光团发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。
[0120]在一些实施方式中，可整体检测经划分的样品中的可检测标记物。例如，可将经划分的样品(如液滴)合并至板(如96孔或384孔板)的一个或多个孔中，并可使用酶标仪检测信号(如荧光信号)。在一些情况中，可在合并划分产物后使用条码来维持划分信息。
[0121]在一些实施方式中，该检测器还包括对经划分的样品(如液滴)的操作能力，通过单独划分的样品进入检测器，进行检测，然后退出检测器。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)可在所述经划分的样品流动时连续检测。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)排列在表面，而检测器相对所述表面运动，在含信号划分产物的各位置检测信号。检测器的示例如WO 2010/036352所示，其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，经划分样品中的可检测标记物可连续检测而无需使经划分的样品流动(如使用载玻片)。
[0122]获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对靶和/或参考序列赋值和量化数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自核酸检测的结果;储存、检索或计算来自核酸检测的原始数据;或者显示、储存、检索或计算可用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。
[0123]在一些实施方式中，主机或任何其他计算机可用于计算样品中存在的序列变体的比例。例如，序列变体(如突变、多态性等)的比例的计算方法可以是:将其中序列特异性检测试剂检测到序列变体的划分产物数目除以其中非特异性检测试剂检测到含有核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的划分产物的划分产物数目。
[0124]在一些情况中，可报告其中序列特异性检测试剂检测到靶核酸与非特异检测试剂检测到核酸的划分产物的比率。在一些情况中，该报告包括诊断或一种或多种诊断的可能性。在一些情况中，该报告包括推荐的治疗，例如药物或化疗剂。在一些情况中，该报告显示在主机的显示屏上。该报告还可储存于计算机可读取介质上，经传输，或打印在人可读取介质上。
[0125]主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，例如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(如TCP/IP)来提供连接;主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，
Windows、MacOS或任何其他操作系统。
[0126]可以多种语言编写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
[0127]主机系统通过用户控制操作的工具有利地提供界面。在本文所述的实施例中，软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解，需要时，可使命令适用于操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。
[0128]可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括:磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
[0129]通过引用将本申请引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。
【主权项】
1.一种核酸序列检测方法，所述方法包括: 提供包含DNA或RNA核酸的样品； 将所述样品划分为一组混合物划分产物； 使用序列特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在靶核酸；以及 使用非特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在双链核酸， 由此检测所述划分产物中靶核酸与总核酸的比率。2.如权利要求1所述的方法，其中，在检测前扩增所述核酸。3.如权利要求2所述的方法，所述非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述非特异性检测试剂是嵌入染料。5.如权利要求4所述的方法，所述嵌入染料选自:EvaGreen、picogreen、溴化乙锭、SYBRGreen KSYBR Go Id、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO 和 BEBO06.如权利要求1、2、4或5中任一项所述的方法，所述非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物。7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述序列特异性检测试剂选自结构化探针和线性探针。8.如权利要求7所述的方法，所述结构化探针选自分子信标和蝎型探针。9.如权利要求7所述的方法，所述线性探针选自杂交探针和水解探针。10.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述核酸是RNA，且所述方法还包括逆转录所述RNA核酸。11.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括扩增两种或更多种潜在扩增子。12.如权利要求11所述的方法，其中，存在有双链核酸的混合物划分产物中，所述潜在扩增子之一的量为小于50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少。13.如权利要求11所述的方法，所述序列特异性检测试剂检测一种特异性扩增子，且所述非序列特异性检测试剂检测任意扩增子。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述序列特异性检测试剂检测序列变体。15.如权利要求14所述的方法，所述序列变体是稀有序列变体。16.如权利要求15所述的方法，其中，双链核酸存在于多个混合物划分产物中，且所述稀有序列变体存在于小于约50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或更少的混合物划分产物中。17.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过计数其中非特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定总核酸浓度。18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括通过计数其中序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定靶核酸序列浓度。19.如权利要求18所述的方法，所述方法还包括确定其中序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物与其中非序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的比率，所述比率表示所述样品中包含所述靶核酸的核酸比例。20.如权利要求19所述的方法，所述方法还包括报告所述比率。21.一种核酸序列检测方法，所述方法包括: 提供包含DNA或RNA核酸的样品，所述DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标； 将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及 使用结合所述第一靶标的特异性检测试剂和结合两种靶标的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的所述第一靶标和所述第二靶标;从而确定所述样品中所述第一靶标的浓度以及所述第一和第二靶标的浓度。22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括在所述混合物划分产物中扩增所述靶标，检测包括检测所述第一和第二靶标的扩增，且所述特异性检测试剂结合若存在则代表所述第一靶标的扩增子，且所述非特异性检测试剂结合若存在则代表所述第一靶标的扩增子和若存在则代表所述第二靶标的扩增子。23.如权利要求21所述的方法，所述检测包括在至少一个混合物划分产物中确定是否存在所述第一靶标并确定是否存在所述第一或第二靶标。24.如权利要求23所述的方法，对多个混合物划分产物进行所述检测。25.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括确定包含所述第一靶标的混合物划分产物与包含所述第一或第二靶标的混合物划分产物的比率。26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括报告所述比率。27.如权利要求21所述的方法，所述第一靶标是突变体或多态性且所述第二靶标是野生型核苷酸序列。28.一种包含小于约10nL的混合物划分产物的组合物，所述组合物包含: 包含DNA或RNA的核酸； 非特异性检测试剂；以及 序列特异性检测试剂。29.如权利要求28所述的组合物，所述组合物还包含扩增试剂。30.如权利要求28所述的组合物，所述非特异性检测试剂选自:EvaGreen、溴化乙锭、SYBR Green^SYBR GoId、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO031.如权利要求28所述的组合物，所述非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物。32.如权利要求28所述的组合物，所述非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸。33.如权利要求28所述的组合物，所述序列特异性检测试剂选自:分子信标、蝎型探针、杂交探针和水解探针。34.一组混合物划分产物，其中，多个所述混合物划分产物包含权利要求28所述的组合物。35.如权利要求34所述的组，所述组包含至少约100、200、500或1000个混合物划分产物。36.如权利要求34所述的组，其中，多个所述混合物划分产物包含双链核酸。37.如权利要求36所述的组，其中，大部分所述包含双链核酸的混合物划分产物不包含靶核酸。38.如权利要求36所述的组，所述靶核酸是序列变体。
【专利摘要】提供了用于检测和定量核酸序列的方法和组合物。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/58, C12Q1/68
【公开号】CN105452486
【申请号】CN201580001152
【发明人】S·蒂佐内弗
【申请人】生物辐射实验室股份有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年1月12日
【公告号】EP2986742A1, US20150197790, WO2015106209A1