ogen)，The Handbook一A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies(《手册--焚光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。
[0072]荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于:花青、酞菁、扑啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基咕吨、吩噻嗪、吩砸嗪、荧光素(例如FITC、5_羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族卩比喃鐵(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、B0DIPY?和B0DIPY?衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒同州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce B1technology，Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。
[0073]在一些实施方式中，用于检测靶分子的序列特异性检测试剂都使用光学试剂标记，且各光学试剂标记的检测试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用光学试剂标记并通过检测该光学试剂生成的信号来检测。
[0074]在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于: 225AC、72As、211At,11B,128Ba,212Bi,75Br,77Br,14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu,18F,67Ga,68Ga,3H,166Ho,1231 ,1241 ,125I
^130K131KlllIn^177Lu^13N^15o^32p^33p^l2pb^103pd^186Re^188Re^47Sc^153Sm^89Sr^99mTc^88Y^p
9()Y。在一些实施方式中，用于检测特异性核苷酸序列的序列特异性检测试剂各自用放射性同位素标记(例如使用第一放射性同位素标记第一检测试剂，使用第二放射性同位素标记第二检测试剂等)，且使用放射性同位素标记的各检测试剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来检测。例如，一种检测试剂可标记有γ发射子，而一种检测试剂可标记有β发射子。或者，这些检测试剂可标记有以可区分的不同能级发射同一粒子(例如，α、β或γ)的放射性同位素。在一些实施方式中，用于检测靶分子的序列特异性检测试剂都使用放射性同位素标记，且各放射性同位素标记的检测试剂都通过检测该放射性同位素生成的信号来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用放射性同位素标记并通过检测该放射性同位素生成的信号来检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂标记有放射性同位素且该非特异性检测试剂标记有光学试剂。在其他情况中，该序列特异性检测试剂标记有光学试剂且该非特异性检测试剂标记有放射性同位素。
[0075]在一些实施方式中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测检测试剂。合适的酶的示例包括但不限于:脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、
半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸盐联用，其产生405nm处可检测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，产生在410nm处可检测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。
[0076]在一些实施方式中，序列特异性检测试剂各自标记有酶(例如第一探针标记有第一酶，第二探针标记有第二酶等)，且标记有酶的各序列特异性检测试剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中，所有用于检测靶核酸的序列特异性检测试剂都使用酶标记，且各酶标记的检测试剂都通过检测该酶生成的产物来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用酶标记并通过检测该酶生成的信号来检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂标记有酶且该非特异性检测试剂标记有光学试剂或放射性同位素。在其他情况中，该序列特异性检测试剂标记有光学试剂或放射性同位素且该非特异性检测试剂标记有酶。
[0077]在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于:生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、Hi s标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
[0078]在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于:寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或 1000个核苷酸。
[0079]在一些实施方式中，该标记物是核酸条码。如本文所用“条码”是专一限定检测试剂分子的或与检测试剂结合的核酸分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。例如，可在不同划分产物中使用含有不同条码序列的引物扩增划分产物中的一种或多种核酸，从而将独特的条码掺入至不同划分产物的经扩增的核酸中。类似地，可在不同划分产物中使用含有不同条码序列的引物逆转录划分产物中的一种或多种核酸，从而将独特的条码序列掺入至不同划分产物的经逆转录的核酸中。替代地或组合地，划分产物中的一种或多种核酸可连接至条码，使得各划分产物中具有不同的条码序列。在一些情况中，序列特异性检测试剂含有对不同划分产物而言独特的条码。在一些情况中，非特异性检测试剂可含有对不同划分产物而言独特的条码。在一些情况中，序列特异性和非特异性检测试剂都含有对不同划分产物而言独特的条码。在这类情况中，对于给定划分产物中的特异性和非特异性检测试剂，这些条码可以是相同的。或者，对于给定划分产物中的特异性和非特异性检测试剂，该条码可以是不同的。随后可合并并任选扩增划分产物而不损失何种划分产物含有核酸的痕迹。然后可对是否存在含有各条码的核酸进行计数(例如通过测序)而无需维持物理划分产物。
[0080]条码序列的长度决定能区分多少独特性样品。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于44或256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标示不多于65536个不同样品。此外，条码可接合至双链核酸的两条链，例如通过用于从RNA模板中合成第一和第二链的条码化引物，通过用于DNA扩增的条码化引物，或者通过连接。在两条链上使用两种不同的条码增加了可区分的独立事件的数量。
[0081]或者，相同条码可接合至双链核酸的第一和第二链。在各划分产物中使用相同的条码(例如通过在用于从RNA模板合成第一和第二链、连接的引物中掺入相同的条码，或通过在DNA扩增期间掺入)可在两条链上产生相同的条码。双重条码化可提供对混杂下游分析的后续检测误差如测序或扩增误差的检验并且允许检测任一条或两条链中而不影响定量。本领域熟知条码技术的应用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等Digital RNA sequencingminimizes sequence-dependent bias and amplificat1n noise with optimizedsingle-molecule barcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码最小化序列依赖性偏置和扩增噪音)，PNAS (2012)和Smith ,AM 等，Highly-multiplexed barcode sequencing: anefficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重条码测序:一种对集中的样品平行分析的高效方法)，Nucleic Acids Research Can 11,(2010)。
[0082]在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40: 2004-2021 (2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如带荧光标记物、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
[0083]接合可检测标记物与检测试剂的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见B1chemical Techniques: Theory and Practice(《生物化学技术:理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(Waveland Press，Inc.)( 1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland，Excited States of B1polymers(《生物聚合物的激发态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983) ；Fluorogenic Probe Designand Synthesis:A Technical Guide(《焚光探针设计与合成:技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied B1systems) (1996);以及G.T.Herman,B1conjugate Techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press) (1996)。
[0084]在一些实施方式中，两种或更多种检测试剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。例如，在一些实施方式中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示是否存在标记物(并因此指示各结合核酸的检测试剂)。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如Maeda等，J B1luminChemilumin 1989,4:140-148。
[0085]检测核酸的方法
[0086]在一些实施方式中，提供了一种核酸序列检测方法，包括:
[0087]提供包含DNA或RNA核酸的样品；
[0088]将所述样品划分为一组混合物划分产物；
[0089]使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及
[0090]使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，
[0091 ]从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。
[0092]在一些实施方式中，提供了一种核酸序列检测方法，包括:
[0093]提供包含DNA或RNA核酸的样品，该DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标；
[0094]将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及
[0095]使用结合第一靶标的特异性检测试剂和结合两种靶标的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的第一靶标和第二靶标;从而确定样品中第一靶标的浓度以及第一和第二靶标的浓度。
[0096]提供样品
[0097]可从基本上任何生物来源提供样品。样品可含有核酸或靶核酸。提供样品包括获得样品和制备样品用于本发明所述方法。例如，可对样品进行纯化、分级、富集或过滤。在一些情况中，可对样品中的核酸进行扩增、转录、逆转录或连接。在一些情况中，提供样品并在划分步骤前使样品接触检测试剂(如序列特异性检测试剂、非特异性检测试剂或其组合)。在一些情况中，划分样品并随后使