低，越显示出高的S/N比。上述 结果表明，这些封闭剂只要以适当的浓度进行使用，则在ELISA中使用BNC-ZZ等探针时均是 有效的。
[0249] 实施例16
[0250] 进行实验以评价HRP标记BNC-ZZ的抗体结合活性。通过ELISA来比较制造例3中制 备的NH2-HRP标记BNC-ZZ和SH-HRP标记BNC-ZZ的抗体结合活性。将源自对照兔的IgG固定化 于ELISA板，使用1%的Blockace对各孔进行封闭。制备按BNC-ZZ蛋白质的量计浓度分别为 0、9.375、18.75、37.5、75、150、300、6001^/11^的!11^标记8%-22溶液，向孔中添加含有终浓 度为0.05 %的Pluronic F-127的roS-T并使其反应，进行清洗后，采用实施例9所示的方法 测定Abs 450nm。结果不于图3〇
[0251] 在所有浓度条件下，以SH-HRP标记BNC-ZZ得到的测定值均比以NH2-HRP标记BNC-ZZ得到的测定值高。尤其是在300ng/mL、600ng/mL的浓度下，以SH-HRP标记BNC-ZZ得到的测 定值是以NH 2 -HRP标记BNC-ZZ得到的测定值的约2 . 1倍~2 . 7倍高。该倍增因子 (multiplication factor)与上述实施例1中所示的两者之间的HRP比活性的差异(前者为 0.844U/yg，后者为0.351UAig，因此高至约2.4倍)几乎为相同水平。上述结果表明，在上述 浓度下，SH-HRP标记BNC-ZZ和NH 2-HRP标记BNC-ZZ均几乎以最大量结合于固定化抗体。另一 方面，在低于上述水平的浓度条件下，以SH-HRP标记BNC-ZZ得到的测定值相对于以NH 2-HRP 标记BNC-ZZ得到的测定值的倍增因子变高，当HRP标记BNC-ZZ浓度为37.5ng以下时，以SH-HRP标记BNC-ZZ得到的测定值平均高至约7.24倍。这表明在低浓度区域，SH-HRP标记BNC-ZZ 以更多的量结合于固定化抗体。考虑到HRP的比活性的差异为约2.4倍的话，上述结果显示， SH-HRP标记BNC-ZZ对抗体的结合亲和性比NH2-HRP标记BNC-ZZ高，为其3倍左右。经由NH 2基 团进行的标记主要是以构成颗粒的BNC-ZZ蛋白质的赖氨酸残基为靶标进行的，由于赖氨酸 残基存在许多抗体结合部位，所以认为经由NH 2基团进行的标记对抗体结合部位造成影响， 结果抑制抗体的结合。另一方面，由于SH基团存在于BNC-ZZ蛋白质的跨膜区域中的露出至 外部的部位，因此可以认为以SH基团为靶标时，不会对抗体结合能力产生影响。
[0252] 因此，对BNC-ZZ进行HRP标记时，经由SH基团进行标记能够更有效地利用BNC-ZZ的 抗体结合能力，并且HRP活性也高，能够形成在对抗体的结合活性和HRP标记方面高约7.2倍 的标记物，由此可得出如下结论:经由SH基团进行的标记显著优异。以下，只要没有特别的 说明，HRP标记BNC-ZZ表示经由SH基团进行标记。
[0253] 实施例17
[0254] 进行实验以研究HRP标记BNC-ZZ在ELISA中的应用。将作为乙型肝炎病毒的表面抗 原的肽的Pre-S2(Beacle，Inc.制，产品编号BCL-AGS2-21)固定化于ELISA板，使用k-Block-e将该板封闭，添加各种浓度的抗Pre-S2小鼠抗体(2APS42，特殊免疫研究所制）。接着，添加 溶解于以终浓度为0.05%含有Pluronic F-127的roS-T中的HRP标记抗小鼠抗体、制造例3 中得到的HRP标记BNC-ZZ〔〕、或同浓度的上述二者的组合并使其反应，进行清洗后，采用与 实施例9同样的方法测定Abs 450nm。结果示于图4。
[0255] 结果确认到：与图4中的黑色圆形标记的"第二IgG"所示的用抗小鼠抗体进行的检 测相比，如图4中的白色三角形标记的"HRP-ZZ"所示，使用HRP标记BNC-ZZ时，灵敏度上升至 10倍左右，并且，如图4中的黑色方形标记的"HRP-ZZ+IgG"所示，并用上述两者时，灵敏度上 升30倍左右。
[0256] 实施例18
[0257] 与实施例17同样地，对使用HRP标记BNC-ZZ的抗体检测型ELISA进行了研究。本实 验中使用的利什曼原虫(Le i shmania pr〇t〇zoa)的重组蛋白质和对照人抗血清均从爱知医 科大学的感染?免疫学系获得。代替Pre_S2而将利什曼病的病原体即原虫的重组蛋白质固 定化于ELISA板，使用k-Block-e将该板封闭，添加各种浓度的对照人抗血清。接着，添加 HRP 标记抗人IgG抗体(其溶解在含有终浓度为0.05%的Pluronic F-127的roS-T中）、制造例3 中得到的HRP标记BNC-ZZ、或同浓度的上述二者的组合并使其反应，进行清洗后，使用ABTS (1-STEP ABTS，Thermo Scientific制)作为底物测定了Abs 405nm。结果示于图5。需要说明 的是，抗体效价的测定值以单位/mL表示。
[0258] 结果确认到：与图5中的黑色三角形标记的"第二IgG"所示的用抗人IgG抗体进行 的检测相比，如图5中的白色方形标记的"HRP-ZZ"所示，利用HRP标记BNC-ZZ时，灵敏度上升 至接近10倍，并且，如图5中的黑色圆形标记的"HRP-ZZ+IgG"所示，并用上述两者时，灵敏度 上升至30倍左右。
[0259] 以上实施例17及18所示的结果表明，HRP标记BNC-ZZ有助于抗体检测型ELISA中的 高灵敏度检测，尤其是在共存有检测抗体时，能够进行更高灵敏度的检测。
[0260] 实施例19
[0261] 进行实验以研究HRP标记BNC-ZZ在ELISA测定中的实践应用。将GFP蛋白质固定化 于ELI SA板，使用k-Bl ock-e将该板封闭。将浓度已知的抗GFP小鼠 I gG抗体作为标准品 (standard )，将稀释100倍以上的小鼠抗GFP抗血清作为试样，分别添加至上述ELI SA板的各 孔中。接着，分别添加制造例3中得到的HRP标记BNC-ZZ (其溶解在含有终浓度为0.05 %的 Pluronic F-127的PBS中）、源自兔的抗小鼠 IgG抗体与HRP标记BNC-ZZ的混合复合体、或源 自兔的HRP标记抗小鼠 IgG抗体并使其反应，进行清洗后，采用与实施例9同样的方法测定 Abs 450nm。测定值如下得至丨」:基于用标准抗体得到的各标准曲线，以mean土 std(ng/mL，η = 3)的形式算出抗血清中的抗GFP小鼠 IgG的浓度。
[0262] 结果，使用HRP标记BNC-ZZ、和HRP标记BNC-ZZ与抗小鼠 IgG的混合复合体测得的值 分别为15613 ±936、15403 ± 1192，与使用HRP标记抗小鼠 IgG抗体定量得到的15400 ± 109非 常一致，由此表明该检测足以作为定量分析。
[0263] 实施例20
[0264]为了评价ALP标记BNC-ZZ的抗体结合活性而进行了实验。将源自对照兔的IgG固定 化于ELISA板，使用1%的Blockace将该板封闭。将50yL的上述制造例4中制作的NH2-ALP标 记BNC-ZZ或SH-ALP标记BNC-ZZ以换算成BNC-ZZ蛋白质的量分别为0、9 · 375、18 · 75、37 · 5、 75、150、300、600ng/mL的浓度添加至各孔中，使其反应后，进行清洗，采用与实施例2同样的 方法测定Abs 405nm。需要说明的是，与ALP标记BNC-ZZ-同使用了终浓度为0.05 %的 Pluronic F-127。结果示于图6。
[0265] 在BNC-ZZ的所有浓度条件下，以SH-ALP标记BNC-ZZ得到的测定值均比以NH2-ALP 标记BNC-ZZ得到的测定值高。尤其是在600ng/mL的浓度下，以SH-ALP标记BNC-ZZ得到的测 定值是以NH2-ALP标记BNC-ZZ得到的测定值的约1.7倍高。该倍增因子与两者之间的ALP比 活性的差异(前者为5.61单位Axg，后者为3.56单位Axg，因此为1.6倍高)几乎为相同水平。 上述结果表明，在上述浓度下，SH-ALP标记BNC-ZZ和NH 2-ALP标记BNC-ZZ均几乎以最大量结 合于固定化抗体。另一方面，在低于上述水平的浓度条件下，以SH-ALP标记BNC-ZZ得到的测 定值相对于以NH2-ALP标记BNC-ZZ得到的测定值的倍增因子变高，当BNC-ZZ浓度为37.5ng 以下时，以SH-ALP标记BNC-ZZ得到的测定值平均为约3.6倍高。
[0266] 上述结果表明，在低浓度区域，SH-ALP标记BNC-ZZ以更多的量结合于固定化抗体。 考虑到ALP的比活性差异约1.6倍的话，上述结果表明，SH-ALP标记BNC-ZZ对抗体的结合亲 和性为NH 2-ALP标记BNC-ZZ的2.3倍高。关于经由NH2基团进行的标记比经由SH基团进行标记 时的抗体结合能力低的原因，认为其与上述实施例16中记载的HRP标记的情形的原因相同。
[0267] 实施例21
[0268] 为了研究ALP标记BNC-ZZ在ELISA中的应用而进行了实验。将源自对照小鼠的IgG (多克隆的）固定化于ELISA板，使用0.5%的酪蛋白将该板封闭。向各孔中添加各种浓度的 制造例4中得到的SH-ALP标记BNC-ZZ或ALP标记源自兔的抗小鼠 IgG抗体并使其反应，进行 清洗后，采用与实施例2同样的方法测定Abs 405nm。
[0269] 需要说明的是，与ALP标记BNC-ZZ-同使用了终浓度为0 · 05%的Pluronic F-127。 结果示于图7。
[0270]与使用经ALP标记的抗体的情况相比，在使用ALP标记BNC-ZZ时，获得了更高效的 反应，这表明ALP标记BNC-ZZ对高灵敏度的抗体检测是有用的。
[0271] 实施例22
[0272] 为了评价HRP标记AGG-BNC-ZZ的抗体结合活性而进行了实验。将源自对照猪的IgG (由Beacle，Inc.利用实施例5的方法制备而得）固定化于ELISA板，然后使用0.5%酪蛋白进 行封闭。向各孔中添加图8中的图的横轴所示的各种浓度的制造例6中得到的HRP标记AGG-BNC-ZZ或制造例3中得到的NH 2-HRP标记BNC-ZZ作为探针，使其反应，进行清洗后，采用与实 施例9同样的方法测定Abs450nm。需要说明的是，探针中添加有终浓度为0.055^^^Pluronic F-127。结果示于图8。
[0273] 如实施例3中所示的那样，已知HRP标记AGG-BNC-ZZ的HRP活性是HRP标记BNC-ZZ的 1/3，因此，如果假定两探针的抗体结合活性相同，则HRP标记AGG-BNC-ZZ与固定化的源自猪 的I gG的反应应当为HRP标记BNC-ZZ的1 /3。
[0274] 但是，实际上，较之HRP标记BNC-ZZ而言，HRP标记AGG-BNC-ZZ的反应为其1/1.1~ 1/2.4左右。这表明HRP标记AGG-BNC-ZZ具有比HRP标记BNC-ZZ更高的抗体结合活性。上述结 果表明，HRP标记AGG-BNC-ZZ及HRP标记BNC-ZZ均具有比抗体更优异的抗体结合活性。
[0275] 实施例23
[0276] 为了评价HRP标记AGG-BNC-ZZ的源自蛋白质G的抗体结合能力而进行了实验。代替 实施例22中所使用的源自对照猪的IgG，将源自小鼠的IgG:(其被认为BNC-ZZ难以与其结 合)固定化，除此之外，与实施例22同样地进行实验。结果示于图9。
[0277] HRP标记AGG-BNC-ZZ显示出了与小鼠 I gG!的高效的结合反应。另一方面，在HRP标 记BNC-ZZ中，则几乎没有检测到结合反应。这表明HRP标记AGG-BNC-ZZ的源自蛋白质G的抗 体结合部位良好地发挥了作用，即使对于源自蛋白质A的抗体结合部位难以与其结合的抗 体，HRP标记AGG-BNC-ZZ也具有高的结合能力。
[0278] 实施例24
[0279] 进行了HRP标记AGG-BNC-ZZ向ELISA中的应用实验。将利用大肠杆菌制造的GFP蛋 白质固定化于ELISA板，然后使用k-Block-e进行封闭。向各孔中以图10中的图的横轴所示 的各种浓度添加源自兔的抗GFP抗体，进而加入lOOng/mL的制造例6中得到的HRP标记AGG-BNC-ZZ或制造例3中得到的SH-HRP标记BNC-ZZ作为探针，使其反应，进行清洗后，采用与实 施例9同样的方法测定A b s 4 5 0 n m。需要说明的是，探针中添加有终浓度为0.0 5 %的 Pluronic F-127。结果示于图 10。
[0280] 与用作对照的SH-HRP标记BNC-ZZ同样地，HRP标记AGG-BNC-ZZ显示出了依赖于所 添加的抗体浓度的反应，但HRP标记AGG-BNC-ZZ的反应为SH-HRP标记BNC-ZZ的约1 /2。考虑 到HRP标记AGG-BNC-ZZ的HRP活性为HRP标记BNC-ZZ的1/3的话，可知HRP标记AGG-BNC-ZZ显 示出了高于HRP标记BNC-ZZ的反应。
[0281] 接着，代替源自兔的抗GFP抗体，对源自小鼠的抗HMG1单克隆抗体（Cosmobi〇 ; IgG〇进行固定化处理，除此之外，采用与上述方法同样的方法进行实验。结果示于图11。
[0282] 将HRP标记AGG-BNC-ZZ用作检测探针时，观察到了依赖于所添加的抗体浓度的反 应，但在使用HRP标记BNC-ZZ的情况下，则几乎没有观察到反应。
[0283] 上述结果表明，HRP标记AGG-BNC-ZZ能够用于抗体检测型ELISA的实践性的测定体 系中。此外，上述结果还表明，HRP标记AGG-BNC-ZZ能够对小鼠 IgGi (其无法使用HRP标记 BNC-ZZ进行检测)进行检测，具有非常高的有用性。
[0284] 实施例25
[0285] 为了研究HRP标记BNC-ZZ/源自兔的抗小鼠 IgG抗体复合体的抗体结合活性而进行 了实验。将源自对照小鼠的I gG固定化于EL ISA板，然后与k-B 1 〇 ck-e反应1小时从而进行封 闭。作为探针，将使用交联剂BS3制造的HRP标记BNC-ZZ/源自兔的抗小鼠 IgG抗体的复合体 (制造例7中得到的）中、用浓度为200μΜ及1000μΜ的交联剂BS3制作的复合体(浓度分别为0、 0.55、1.65、4.94、14.8、44.4、133、400ng/mL的）添加至各孔中并使其反应，进行清洗后，采 用与实施例9同样的方法测定Abs 450nm。需要说明的是，探针中添加有终浓度为0.05%的 Pluronic F-127。结果示于图 12。
[0286 ]观察到了依赖于所使用的复合体的浓度的反应。对制备时的交联剂浓度为20 0μ Μ 和1000μΜ的复合体进行比较，结果表明，虽然后者的结合活性稍微降低，但两者均显示出了 实用水平的抗体结合活性。
[0287] 实施例26
[0288] 进行实验以验证通过用卵清蛋白（ovalbumin，0VA)免疫而得到的抗0VA小鼠抗血 清中存在的抗0VA小鼠 I gE、抗0VA小鼠 I gG两者是否能够被实际测量。将0VA固定化于EL ISA 板，然后使用h-Block-e进行封闭。向该板中加入稀释100倍以上的各抗0VA小鼠抗血清。作 为I gE测定用探针，使用制造例3中得到的SH-HRP标记BNC-ZZ与抗小鼠 I gE (Nor d i c Immunology Lab制)复合体(按照制造例7的方法使用浓度为1000μΜ的BS3进行制备）、和HRP 标记抗小鼠 I gE。作为I gG测定