CR Bufferll (Mg2+ plus)化1，Taq 0.1yl，dNTP Mixture(2.5m)1.50yl，上下 游引物各0.5y 1，引物序列为：AhRESS-pr imer-F: 5 ' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3 ' 和 AhRESS-primer-R:5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'。PCR反应条件为：94°C 5 min一（94°C 30 s一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。结果表明，AhRESS 基因已经整合到本生烟草发状根基因组中。
[0051 ]【实施例6】转基因花生发状根AhRESS基因 RT-PCR鉴定 1.转基因花生发状根总RNA的提取 取1 g发状根置于研鉢中加液氮研磨，取O.lg倒入预冷的0.5ml异硫氯酸脈变性匀浆 液中，充分混匀Imin。加入0.1ml 2mol/L NaAc (抑4.0)混匀Imin;加入0.5ml水饱和酪，振 荡30秒，冰浴5min。加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡2次3min，冰上放置lOmin。4°(3， 12000g离屯、15min。小屯、移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积酪:氯仿：异戊 醇(25:24:1)，振荡2次3min，冰上放置5min。4°C，12000g离屯、10-15min，移取上层水相，弃去 中间和下层有机相。加入等体积异丙醇，放置-20°C 30分种W沉淀RNA"4°C，12000g离屯、 15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涂沉淀；将RNA沉淀在空气中干燥。用30ul R化se-free d地20或去离子甲酯胺溶解RNA沉淀。
[0052] 2.转基因花生发状根RT-PCR 取转基因花生发状根总RNA化g，按按照逆转录试剂盒中的反应体系，进行逆转录。 μ1稀释3倍的逆转录产物为模板，依次加入灭菌蒸馈水14.化1 aOXPCR Bufferll (Mgh plus)化1，Taq O.lyl'dNTP Mixture(2.5m)1.50yl，AhRESS-p;rime;r-F( 5' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3'）和AhRESS-primer-R(5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）各 O-SylnPCR反应条件为：94°C 5 min一（94°C 30 s一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles 一72°C 10 min一4°C保存。RT-PCR电泳结果如图2,表明AhRESS基因已在转基因本生烟草发 状根中表达。
[0053] 【实施例7】转基因花生发状根白襲芦醇的提取 取-80°C保藏的发状根和新鲜葡萄皮，分别准确称重0.5 g，于液氮中研磨充分，分别置 于离屯、管中，加入5血甲醇，于60°C水浴中提取1 h，6000巧m离屯、10 min,收集上清，重复 Ξ次，合并上清液，过滤后于45°C旋转蒸发至近干，用甲醇定容至2 mL，用0.22 WI1滤膜过 滤，得到预处理的样品溶液，备用。
[0054] 【实施例8】转基因花生发状根白襲芦醇含量的HPLC测定 1.白襲芦醇HPLC检测色谱条件:色谱柱0DS (250 mmX4.6 mmX5皿），流动相乙腊： 水(25:75)，流速1.〇11117111111，检测波长306 11111，柱溫25°(3，进样量10化。
[0055] 2.白襲芦醇标准品储备液的制备:精确称取白襲芦醇标准品5.0 mg，用甲醇(色 谱纯)溶解并定容至50 mL，得到100 mg/L的白襲芦醇标准品储备液，置于4°C冰箱中避光保 存，备用。
[0056] 3.白襲芦醇标准工作液的制备：分别准确移取白襲芦醇标准品储备液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL用甲醇(色谱纯)稀释并定容至1000 mL，得到一系列的白襲芦醇标准 品工作液，其质量浓度分别为0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L。
[0057] 4.标准曲线的绘制：W质量浓度分别为0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L的白襲芦醇标准品溶液各10化分别进样，测得峰面积与白襲芦醇含量之间 的关系，绘制标准曲线。 5.发状根中白襲芦醇含量的测定:取预处理样品溶液各10化进样，每样品各做Ξ个 重复，根据标准曲线算出各株系发状根中白襲芦醇的含量，取平均值作为实验结果。结果表 明，利用有机溶剂浸提法提取转基因花生发状根中白襲芦醇，经高效液相色谱(HPLC)测定， 其白襲芦醇含量最高为66.1化g/g(FW)，是未转基因发状根中白襲芦醇含量的3倍(图4)。
[0058] W上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，其特征在于：包括 以下步骤： (1)烟草根特异启动子NTR2驱动花生白藜芦醇合酶基因 AhRESS表达载体pBI 121-NTR2-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生； (2 )转pBI 12 l-NTR2-AhRESS花生发状根液体悬浮培养； (3)转pBI121-NTR2-AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测。2. 根据权利要求1所述的特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方 法，其特征在于:步骤(1)的具体方法为： 1) 将烟草根特异启动子NtR2连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-NtR2载体； 2. pBI121-NtR2-GUSA载体构建:利用限制性内切酶BamHI及SacI对pBI121质粒载体进 行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从pCAMBIA1301载 体中克隆⑶SA基因，连接至酶切后的pBI121载体上，得到pBI121-GUSA载体;将pBI121-GUSA 载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接 至pB1121-GUSA载体中，得到pB1121 -NtR2-GUSA载体； 3. pBI 121-NtR2-AhRESS载体的构建:将花生白藜芦醇合酶基因 AhRESS基因，并连接到 pB1121 -NtR2-GUSA载体中，得到pB1121 -NtR2-AhRESS载体。3. 根据权利要求2所述的特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的 方法，其特征在于:所述步骤（1)中烟草根特异启动子NTR2的序列为SEQ ID No: 1，花生白藜 芦醇合酶基因 AhRESS的序列为SEQ ID No:2。4. 根据权利要求1所述的特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方 法，其特征在于:所述步骤(1)中发根农杆菌介导的花生遗传转化外植体分别为叶片、子叶、 上胚轴和下胚轴外植体。5. 根据权利要求1所述的特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的 方法，其特征在于:所述步骤(2)中转pBI 121-NTR2-AhRESS花生发状根液体悬浮培养所用培 养基为MS培养基+500 mg/L Cef，第一次继代培养基为MS培养基+300 mg/L Cef，第二次继 代培养基为MS培养基+100 mg/L Cef，第三次继代培养基为MS培养基;三次继代后头孢霉素 浓度降至0。6. 根据权利要求1所述的特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的 方法，其特征在于:所述步骤(3)中转pBI 121-NTR2-AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测 方法为HPLC，色谱条件为:色谱柱0DS，流动相乙腈:水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长 306 nm，柱温25°C，进样量 10 yL〇
【专利摘要】本发明涉及特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，属于植物基因工程领域。利用发根农杆菌介导将烟草根特异启动子NTR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS载体pBI121-NTR2-AhRESS遗传转化花生，获得特异表达AhRESS的转基因花生发状根。利用有机溶剂浸提法提取转基因花生发状根中白藜芦醇，经高效液相色谱（HPLC）测定，其白藜芦醇含量最高为66.16μg/g（FW），是未转基因发状根中白藜芦醇含量的3倍。本发明为利用烟草根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在花生发状根中特异表达，进而生产白藜芦醇提供了良好的基础。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/06
【公开号】CN105505990
【申请号】CN201610025960
【发明人】陈华, 庄伟建, 马世伟, 张冲, 蔡铁城, 邓烨
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月15日