应用寡聚体dT分子来避免生成由多聚A载运体诱导的高分子量PCR产物的制作方法
【专利说明】应用真聚体dT分子来避免生成由多聚A载运体诱导的高分子 量PCR产物
[0001] 发明背景
[0002] 在RNA分离期间，使用载运体karrier)核酸如多聚A-RNA(PO1 yA-RNA) W增加分离 的RNA的收量(yield)。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆 转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此设及用于逆转录的方法和试剂盒W及封闭性核酸分子 (blocking nucleic acid)用来封闭载运体多聚A-RNA的用途。
[0003] 将少量病毒RNA分离出血浆需要一种确保RNA的低损失率的方法，运是对病毒基因 组的进一步分析所需要的。可使用不同方法分离病毒RNA。一种最常见的方法是手动RNA分 离。对于大多通过基于柱的方法进行的血浆中的手动RNA分离，使用载运体RNA，像多聚A、 MS2RNA或tRNA来抑制祀RNA对柱材料的不可逆结合。另外，已显示合成的多聚A载运体RNA增 强RNA对分离柱中二氧化娃(sliica)表面的可逆结合，运也导致增加的RNA收量(DN.化ngen 等，Trends of Biochemical Sciences 1996,21,224-225;ML.Gallagher等Biochemical and Bio地ysical Research Communications 1987,144,271-276)。载运体RNA封闭柱材 料，从而可将祀RNA定量分离出血浆样品。使用载运体RNA还可具有另外的有益效果，如改进 祀RNA稳定性（D .Andreas en等，Methods 2010 ,50, S6-S9;R.Kishore等， J. forensic.Sci.2006,51(5),1055-1061)。
[0004] 在分离后，实施RNA的逆转录W生成cDNA用于后续PCR反应。将多聚A-RNA作为RNA 载运体用于分离步骤和将随机六聚体引物用于逆转录步骤，在PCR反应期间产生不想要的 非特异性的高分子量产物，其来自多聚A-RNA分子和能结合多聚A-RNA的随机六聚体引物的 一部分的杂交。然后，该高分子量杂交产物在PCR期间扩增，其在琼脂糖凝胶上可见为高分 子量(HMW)拖尾带(3111日日'）。曲柳产物的生成最终导致更低量的扩增的祀0臟。
[0005] 因此，本说明书的目的是提供不显示上述缺点的方法。
[0006] 发明概述
[0007] 发现如果通过在3'端封闭的寡聚体dT分子(oligo-dT molecules)来封闭用作载 运体的多聚A-RNA，则可W防止上文描述的HM产物，该产物不利地影响逆转录后的规程。 [000引因此，本说明书设及逆转录方法，其中所述方法包括W下步骤:曰)提供包含RNA的 样品，b)使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物，C)在如下条件下将该混合物施加 到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸对所述基质的结合，d)将所述基质与所 述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运体核酸，e)从所述基质洗 脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物，f)在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性 核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所述载运体核酸的杂交，g)在如下条件下向来自 步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述RNA的杂交，和h)将所述RNA逆 转录成cDNA。
[0009] 在一个具体的实施方案中，所述载运体核酸是RNA载运体。在一个更具体的实施方 案中，所述RNA载运体是多聚A-RNA。
[0010] 在一个具体的实施方案中，所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。在一个更具体的实 施方案中，所述寡聚体dT分子是5'-(dT)n-X-3'，其中所述(dT)n是η聚体同型2'-脱氧-胸巧 寡核巧酸，其中所述η是18、19、20、21或22，其中所述乂选自下组：口、口〔3、口〔3口、口〔3口〔3和 pC化C3p，且其中X结合于(dT)n的3'末端径基基团且其中Ρ是憐酸根和C3是1,3-丙二醇间隔 物。在一个甚至更具体的实施方案中，η是20且X是pC化C3p。
[0011] 在一个具体的实施方案中，引物是随机引物。在一个更具体的实施方案中，所述随 机引物是随机六聚体引物。
[0012] 在一个具体的实施方案中，所述基质包含玻璃纤维绒(glass fiber fleece)。
[0013] 在一个具体的实施方案中，所述样品选自下组:血清、血液、血浆、泪（tear)、细胞 培养上清、尿和母乳(breast mi化）、唾液、脑脊髓液和精液。
[0014] 本说明书进一步设及封闭性核酸分子用于在逆转录期间封闭载运体多聚A-RNA的 用途，其中所述封闭性核酸分子是5'-(dT)n-X-3'，其中所述(dT)n是η聚体同型2'-脱氧-胸 巧寡核巧酸，其中所述11是18、19、20、21或22，其中所述乂选自下组：口、口〔3、口〔3口、口〔3口〔3和 pC化C3p，且其中X结合于(dT)n的3'末端径基基团和其中Ρ是憐酸根和C3是1,3-丙二醇间隔 物。在一个具体的实施方案中，η是20且X是pC化C3p。
[0015] 本说明书进一步设及用于实施逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含a)作为载运体的 多聚A-RNA，和b)如上文描述的封闭性核酸。
[0016] 附图简述
[0017] 图1:该图显示了在有和无逆转录前的寡聚体dT预处理的情况下，使用针对HCV基 因型la的HCV特异性引物组的PCR产物的比较。比较不同浓度的寡聚体肌和不同浓度的HCV cDNA。
[0018] 图2:该图显示了在有和无逆转录前的寡聚体dT预处理的情况下，使用针对HCV基 因型la的肥V特异性引物组的PCR产物的比较。W不同浓度的HCV cDNA比较不同浓度的寡聚 体肌。
[0019] 发明详述
[0020]列出W下定义W例示和定义本文中使用的多个术语的含义和范围。
[0021 ]术语"一个"、"一种"和"该"一般包括复数指代物，除非上下文清楚地另外指示。
[0022] 如本文中使用的，术语"约"连同数值通过扩展数值的上限和下限来修饰该数值。 一般地，术语"约"修饰所述数值为差异为高5%的数值和低5%的数值。例如，"约100"的值 意为巧5至105"的范围。
[0023] 术语"扩增"一般指从祀核酸产生多个核酸分子，其中引物与祀核酸分子上的特定 位点杂交W提供由聚合酶延伸的起始位点。扩增可通过本领域中一般已知的任意方法进 行，如但不限于:标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和等溫扩增。
[0024] 术语"3'-封闭的引物"在本文中如本领域专业人员所知的使用，且指在其末端3' 径基基团由封闭性基团修饰的寡核巧酸，该封闭性基团能阻止通过聚合酶反应的引物延 伸。适宜的封闭性基团具体为不含有2'-脱氧核糖模块的任意基团。运类封闭性基团为例如 但不限于憐酸根(phosphate),经取代的憐酸根如烷基或芳基取代的憐酸根，酸基团如烷基 酸如甲基、乙基或苯甲基，3'-脱氧核糖衍生物如2'，3'-双脱氧核巧或在扩增条件下稳定的 任何其他径基保护性基团，如醋如苯甲酸醋或硝酸醋。经取代的憐酸根可W多重渗入至3' 末端径基基团，其通过使用二醇，如烧二醇，像1,3-丙二醇(本文中称为C3-间隔物或C3)。为 了易于合成运类用3'-憐酸根或经取代的憐酸根封闭的引物，可W使用商品化的3'-憐酸-CPG或3 '-间隔物C3CPG或3 ' -憐酸-CPG连同间隔物C3亚憐酷胺（phosphoramidite) (Glen Research Corporation,Sterling,VA)的应用。尤其适用的是3'-径基修饰如憐酸根(p)、憐 酸-1,3-丙二醇(pC3)、憐酸-1,3-丙二醇-憐酸(pC3p)、憐酸-1,3-丙二醇-憐酸-1,3-丙二醇 (pC3pC3)或憐酸-1,3-丙二醇-憐酸-1,3-丙二醇-憐酸(pC3pC化）。
[0025] 术语"载运体核酸"在本文中如本领域专业人员所知的使用，且指不同类型的RNA， 如多聚A-RNA、tRNA和MS2RNA。运类不同的载运体RNA通常起源于隧菌体。载运体核酸用于增 加核酸分离规程期间少量祀核酸如祀RNA的回收。运类分离意味着从样品分离祀核酸，例如 通过使用固相。一般地，向包含祀核酸的样品大量添加载运体核酸。载运体核酸的量相比于 祀核酸大得不成比例。载运体核酸和祀核酸竞争例如退化(degeneration)过程(酶促、物 理、化学），由此保护祀核酸。由于载运体核酸的较大量，其相比于祀核酸按比例更强地受运 类过程的影响。因此，祀核酸受到的影响程度低得多，由此增加了祀核酸的收量。载运体核 酸是本领域中公知且商业可获的。
[0026] 如本文中使用的，术语"杂交"用于提述互补性核酸的成对。杂交和杂交的强度（即 核酸之间的联合强度)受到因素如核酸之间互补程度、设及的条件的严格性、形成的杂合体 的Tm、和核酸内G:C比率的影响。虽然本发明不限于一组具体的杂交条件，但优选采用严格 杂交条件。严格杂交条件是序列依赖性的且随着不同环境参数(例如，盐浓度和有机物的存 在)而变化。一般地，"严格'条件选择为比特定核酸序列在限定的离子强度和抑的热烙解点 (Tm)低约5°C至20°C。优选地，严格条件比结合于互补核酸的特定核酸序列的热烙解点(Tm) 低约5°C至ICrCnTm是50%的核酸(例如标签核酸)与完美匹配的探针杂交的溫度(在限定的 离子强度和抑下）。
[0027] 如本文中使用的，术语"基质"指被核酸特定结合而污染性物质不结合的表面。更 具体地，基质是玻璃纤维绒的二氧化娃表面，其能包含在核酸分离柱中。通过使包含核酸的 样品与运类基质接触，核酸在存在离液盐的情况下结合于玻璃纤维绒的表面。运允许基质 特定地固定化核酸。为了使RNA结合基质，可W相应地优化结合条件W确保RNA的增加的固 定化。核酸的分离通过将核酸特定地结合于玻璃纤维绒来实现，而污染性物质（如盐、蛋白 质和其他组织污染物)不与其结合。为了从基质除去DNA，可在其上直接用DNA酶消化结合于 基质的核酸。在除去消化的DNA片段和其他污染性物质(例如通过清洗)后，可随后在小体积 的水或低盐缓冲液中洗脱剩余的分离的RNA。
[00%]术语"核酸"一般指DNA或RNA，不管其为扩增产物，合成创造的，RNA逆转录的产物 还是天然存在的。核酸通常是单链或双链分子且由天然存在的核巧酸组成。双链核酸分子 可具有3 '或5 '悬突，如此不需要或推定为在其整个长度上都是完全双链的。此外，术语核酸 可由非天然存在的核巧酸和/或对天然存在的核巧酸的修饰构成。在本文中列出了