T保护的寡核巧酸并通过RP册LC(柱： PRPUHamiltonpartno.79352))纯化，其使用0，lMΞ乙基乙酸锭pH7/乙腊梯度。组合产 物级分并通过对水渗析(丽〔0 1000,5口6。付曰口〇'6,口曰1'1：]1〇.132638)3天来脱盐，由此还切 割DMT基团。最后，将寡核巧酸冻干。
[0074] 收量:360纳摩。
[00巧]实施例4
[0076] 载运体RNA的封闭
[0077] 为了阻止高分子量产物的生成，将化g、2.5yg和1.25yg的寡聚体dT(5'-(dT)20-pC3pC化-3'）添加至分离的RNA。使用具有W下浓度的不同的肥V病毒载量血浆样品：5,000 拷贝/ml;25,000拷贝/ml;50,000拷贝/ml (见图1)。
[007引为了阻止高分子量产物的生成，将2.化g、1.25yg和0.62扣g的寡聚体dT添加至分 离的RNA。HCV病毒载量血浆样品浓度为5，000拷贝/ml (见图2)。
[0079] 实施例5
[0080] 逆转录
[0081] 在逆转录之前，将不同量的寡聚体dT添加到如实施例4中描述的浓缩的RNA样品。 然后，使用Transcriptor First Strand cDNA合成试剂盒（Roche Dia即ostics GmbH, Mat. :0489703001)与用于引发的随机六聚体引物(畑)组合实施逆转录。将13.5μ1的样品与 4μ1 400μΜ RH混合，接着是在65°C达lOmin的变性步骤。之后，将样品立即放置在冰上，并添 加祉1的试剂主混合物。每份反应，主混合物由化1转录酶反应缓冲液(5χ)、0.5μ1 R化se抑 制剂(4〇υ/μ1)、2μ1 dNTP混合物(各lOmM)和0.化1逆转录酶(4〇υ/μ1)组成。将反应在25°C溫 育25min(溫育步骤），接着是在50°C 60min(逆转录），最后是在85°C5min(使逆转录酶失 活）。接着，添加1ml RNase(lU/ml)，之后在37°C溫育20min。将生成的cDNA用作模板用于后 续PCR反应。
[0082] 实施例6 [008；3] PCR
[0084] 将针对HCV基因型1 a的HCV特异性引物组用于扩增。对于扩增子PCR，使用Fa S t 8化的高保真PCR系统（Roche Dia即ostics GmbH,Mat. :04738284001)和PCR核巧酸混合物 (Roche Dia即ostics GmbH,Mat. : 11581495001)。主混合物由 12.7化1 此0(PCR级），2.化 1 lOx Fast 8化的 PCR反应缓冲液（包含 18mM MgCl2)，lyl DMSO，lyl dNTP(各lOmM)和0.75μ 1 Fast 8化的高保真酶巧υ/μ1)组成。添加化1的正向和逆向引物(各lOmM)和化1的cDNA。将 板密封、短暂离屯、并入表1中所示的溫育(扩增程序）。
[0085]
[00化]实施例7
[0087] 凝胶电泳
[0088] 为了分析生成的PCR产物，实施使用1%琼脂糖凝胶的凝胶电泳。因此，将1%琼脂 糖溶解于lx TBE(化is-Borat-EDTA)缓冲液中。将溶液加热直至所有琼脂糖晶体均溶解。向 冷却的溶液小屯、添加每1ml的lx TBE缓冲液0.06μ1的漠化乙晚。接着，将琼脂糖溶液诱置于 期望的凝胶盒中。在加载样品之前，将一份lOx Blue化ice上样缓冲液(Invit;rogen,Mat.: 10816015)施加到4份样品。另外，将6μ1的DNA分子量标志XIII 50碱基对梯（Roche Diagnostics GmbH,Mat. : 11721925001)填充到另一个凝胶袋中。W120V实施电泳35min，之 后使用UV光盒使DNA条带可视。如下加载琼脂糖凝胶。
[0089] 图1中绘出的琼脂糖凝胶如下加载:右道:6μ1分子量标志物。N:对照，无 (w/o)试剂 混合物的水对照。有寡聚体dT:NC:阴性对照，道NC 1、NC 2、NC 3-不包含样品材料，将肥V特 异性引物添加到PC时式剂混合物，用水代替肥V cDNA;将不同预处理浓度的寡聚体肌添加至 阴性对照；NC 3 = 1.25yg寡聚体dT，NC 2 = 2.5yg寡聚体dT，NC 1 =扣g寡聚体dT。寡聚体dT 样品5:HCV样品-5,000拷贝/ml:在逆转录前W下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预处 理的情况下扩增浓度为5，000拷贝/ml的肥V cDNA:道5-3 = 1.25yg寡聚体dT，道5-2 = 2.扣g 寡聚体dT，道5-3 =扣g寡聚体dT。寡聚体dT样品25: HCV样品25，000拷贝/ml:在逆转录前W 下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预处理的情况下扩增浓度为25,000拷贝/ml的HCV cDNA:道5-3 = 1.25yg寡聚体肌，道5-2 = 2.扣g寡聚体肌，道5-3 =扣g寡聚体肌。寡聚体肌样 品100: HCV样品100，000拷贝/ml:在逆转录前W下述不同浓度的寡聚体dT进行寡聚体dT预 处理的情况下扩增浓度为100，000拷贝/ml的HCV cDNA:道5-3 = 1.25yg寡聚体dT，道5-2 = 2.5yg寡聚体肌，道5-3 =扣g寡聚体肌。无 (w/o)寡聚体肌:样品25:HCV样品25,000拷贝/ml: 扩增浓度为25，000拷贝/ml的HCV cDNA，在逆转录之前没有寡聚体dT预处理。
[0090] 如下加载图2中绘出的琼脂糖凝胶:右道:6μ1分子量标志物。N:对照，无试剂混合 物的水对照。有寡聚体dT:NC:阴性对照（不包含样品材料），向PC时式剂混合物添加 HCV特异 性引物，使用水取代肥V cDNA，寡聚体dT预处理W浓度为0.62扣g的寡聚体dT进行。寡聚体 扣样品0.62化旨:扩增浓度为5,000拷贝/1111的肥￥。0魁样品，在逆转录之前使用0.62扣邑寡 聚体dT预处理。寡聚体dT样品1.25yg:扩增浓度为5,000拷贝/ml的肥V cDNA样品，在逆转录 之前使用1.25yg寡聚体dT预处理。寡聚体dT样品2.扣g:扩增浓度为5,000拷贝/ml的HCV cDNA样品，在逆转录之前使用2.扣g寡聚体dT预处理。没有(w/o)寡聚体dT样品：扩增浓度为 5，000拷贝/ml的HCV cDNA样品，在逆转录之前没有寡聚体dT预处理。
[0091] 观察到的结果：
[0092] 如可从图1看到的，对于所有HCV cDNA样品生成了特定的39化P PCR产物。在逆转 录前有寡聚体dT预处理的样品中没有生成高分子量产物(有寡聚体dT:道1、2和3,分别对应 于样品5、25和100)。然而，在逆转录前没有寡聚体dT预处理的样品中生成了高分子量产物 (无寡聚体dT:样品25,两道）。
[0093] 如可从图2看到的，该特定的392bp PCR产物存在于除了2.化g寡聚体dT样品中的 一个重复和无寡聚体dT的样品中的一个重复W外的所有样品中。在逆转录前有寡聚体dT预 处理的样品中没有生成高分子量产物(有寡聚体dT:样品0.62化g、1.25yg和2.化g)。显示 0.625yg寡聚体dT完全阻止高分子量产物生产且限定为要使用的寡聚体dT的量。在无寡聚 体dT的样品中，存在高分子量产物。
【主权项】
1. 一种逆转录方法，其中该方法包括以下步骤： a) 提供包含RNA的样品， b) 使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物， c) 在如下条件下将该混合物施加到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸 对所述基质的结合， d) 将所述基质与所述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运 体核酸， e) 从所述基质洗脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物， f) 在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所 述载运体核酸的杂交， g) 在如下条件下向来自步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述 RNA的杂交，和 h) 将所述RNA逆转录成cDNA。2. 权利要求1的方法，其中所述载运体核酸是RNA载运体。3. 权利要求2的方法，其中所述RNA载运体是多聚A-RNA。4. 权利要求1-3的方法，其中所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。5. 权利要求4的方法，其中所述寡聚体dT分子是5'-(dT)n-X-3'，其中所述(dT)n是η聚 体同型2'-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述η是18、19、20、21或22,其中所述X选自下组:ρ、 pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3'末端羟基基团且其中ρ是磷酸根和 C3是1，3_丙二醇间隔物。6. 权利要求5的方法，其中所述η是20且X是pC3pC3p。7. 权利要求1-6的方法，其中所述引物是随机引物。8. 权利要求7的方法，其中所述随机引物是随机六聚体引物。9. 权利要求1-8的方法，其中所述基质包含玻璃纤维绒(glass fiber fleece)。10. 权利要求1-9的方法，其中所述样品选自下组:血清、血液、血浆、泪、细胞培养上清、 尿和母乳、唾液、脑脊髓液和精液。11. 封闭性核酸分子用于在逆转录期间封闭载运体多聚A-RNA的用途，其中所述封闭性 核酸分子是5'-(dT)n-X-3'，其中所述(dT)n是η聚体同型2'-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述 η是18、19、20、21或22，其中所述乂选自下组:？、？03、？03?、？03?03和?03?03?，且其中乂结合于 (dT)n的3'末端羟基基团和其中ρ是磷酸根和C3是1，3_丙二醇间隔物。12. 权利要求11的用途，其中所述η是20和X是pC3pC3p。13. 用于实施逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含： a) 作为载运体的多聚A-RNA，和 b) 根据权利要求11和12的封闭性核酸。
【专利摘要】在RNA分离期间，使用载运体核酸如多聚A-RNA以增加分离的RNA的收率。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此涉及用于逆转录的方法和试剂盒以及封闭性核酸分子用来封闭载运体多聚A-RNA的用途。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68
【公开号】CN105531381
【申请号】CN201480050339
【发明人】F.伯格曼, S.弗勒纳
【申请人】霍夫曼-拉罗奇有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月10日
【公告号】CA2923083A1, EP3044326A1, US20150079600, WO2015036434A1