生物样品中进行生物发光共振能量转移(bret)分析的方式和方法
【专利说明】生物样品中进行生物发光共振能量转移(B化Τ)分析的方式和 方法
[0001] 本发明设及使用发光进行体外检测方法的领域。发光是能量特异引导至分子W产 生激发态的现象。回到低能量状态伴随着光子的释放。发光包括巧光、憐光、化学发光和生 物发光。发光可用于分析游离分析物或生物相互作用。
[0002] 2009年，发明人提出了生成针对小分子分析物的半合成蛋白质基的生物传感器的 方法。巧光生物传感器称为挪ap-标签指示蛋白，具有巧光分子内系连(Snifit)。参见化un 等J Am Chem Soc.2009;131(16):5873-84和化un等J Am Chem Soc.2011;133(40):16235- 42。
[0003] 重要的是，Snif it是比率型(rat iome化ic)传感器，由单分子组成，其允许独立于 实际传感器浓度而形成传感器读数。Snifit传感器由SNAP-标签、巧光蛋白和代谢物-结合 蛋白组成。SNAP-标签用合成分子特异标记，所述分子含有代谢物-结合蛋白的配体和巧光 团。在标记的传感器中，感兴趣的代谢物从所述结合蛋白中置换分子内配体，从而将传感器 蛋白从封闭构型变为开放构型。读数是巧光蛋白和系连的巧光团的巧光强度中的伴随比率 型变化。因此，分析物的存在与否导致传感器蛋白中的构型改变，从而两个巧光团相对彼此 的位置改变，并且因此它们（读数)之间的FRET的效率也发生变化。通过选择合适的结合蛋 白和其相关可系连配体，事实上任何小代谢物均可被检测，并且公开了数个示例。参见化un 等J Am Chem Soc. 2012; 134( 18) :7676-8和Masharina等J Am Chem Soc.2012; 1:34(46): 19026-34。
[0004] 然而，当前已知的Snifit-方法至少受下述缺陷的限制：（i)比率变化较小并且目 前没人能确定通过提高闭合状态中的RET效率来提高比率变化的方法；（ii)将比率型RET传 感器直接用于定量吸收传感器的发射波长处光的复合样品（例如血清或其他体液）中的分 析物易于出现假象，得到不可靠的分析结果。
[0005] 为了确定通过使用传统Snifit提高闭合传感器中的RET效率来进一步改善比率变 化的策略的大量尝试均告失败(14〔5,2011(133，16235-16242)。此外，复合样品可包含各种 浓度的巧光分子，运会干扰定量。比率型读数还会受到样品（例如血清或其他体液)光吸收 的影响，从而使定量易于出现误差。
[0006] 而理论上，基于作为内光源的巧光素酶的传感器（即BRET)会降低巧光背景问题并 可能提高灵敏度，当前尚未提出适用于光吸收样品中分析物的混合-和-测量定量的比率型 BRET基的传感器。
[0007] 尽管生物发光技术的（医药)应用中有大发展，但当前没有可用的BRET基、便携、混 合-和-测量传感器用于分析物的精确床边(point-of-care)定量(例如用于监控治疗药物） 的事实表明产生此类传感器所面临的技术难度。
[000引因此发明人提供比率型发光传感器及其使用方法，所述传感器包括由比率变化得 到改善的单分子或由其组成，其克服了至少部分上述缺陷。具体地，其旨在结构优化产生较 高的信号改变，并使传感器可用于直接定量分析物，例如体液或其他复合物、光吸收样品中 的药物、代谢物或蛋白质。优选地，检测应与便携相机或智能手机兼容。
[0009] 发现运些目标可通过提供特别设计的传感器分子实现，所述传感器分子包括含巧 光素酶和分析物的结合伴侣的蛋白质部分，其中所述部分与巧光团和分子内配体系连，所 述配体与感兴趣的分析物竞争结合所述结合伴侣。不存在分析物时，分子内配体结合所述 结合伴侣，巧光团与巧光素酶紧密相邻，当巧光素底物存在时则发生强烈的生物发光共振 能量转移(BRET)。相反，当感兴趣的分析物W足W置换分子内配体的浓度存在时，传感器变 为开放构型，并且巧光素酶和合成的巧光团之间距离增加，产生较低的BRET-效率。参见图 1-4的代表性传感器图示。令人惊奇的是，发现通过提高闭合状态中的RET效率，Snifit中巧 光蛋白与巧光素酶的交换产生比率变化显著（2倍)增加的传感器。该预料之外的改进对传 感器的实际应用非常重要。此外还惊奇的发现，通过将BRET传感器和所述样品吸附至固体 载体(例如纸)或通过在测量前将BRET传感器固定至固体载体例如玻璃表面，样品在传感器 的发射波长处的吸收干扰最小。运就可W分析复杂样品，例如血清。
[0010] 因此，在一个实施方式中，本发明提供使用生物发光共振能量转移(BRET)检测样 品中感兴趣分析物的传感器分子，所述传感器分子包括系连至合成的调节分子的蛋白质部 分，其中
[0011] (i)所述蛋白质部分包含连接至结合蛋白（BP)的巧光素酶化UC)，所述结合蛋白 (BP)能结合所述感兴趣的分析物；
[0012] (ii)所述合成的调节分子包含能分子内结合BP的配体化），W及存在合适Luc底物 时能接受通过共振能量转移(RET)来自所述Luc的能量的巧光受体，和
[0013] (iii)其中分析物与BP的结合导致传感器分子的开放和闭合状态之间的平衡发生 变化，从而导致BRET功效的变化。
[0014] 在一个实施方式中，分析物和L与BP的结合互相排斥，从而没有分析物时L结合BP， 得到传感器分子的闭合构型，其中巧光受体与Luc空间上紧密相邻，使得BRET得W发生；当 存在分析物时，其从BP中置换L，得到传感器分子的开放构型，从而BRET效率降低。
[0015] 在另一实施方式中，分析物和L与BP的结合彼此协同，从而没有分析物时L不结合 BP，得到传感器分子的开放构型，其中仅发生低BRET效率;当分析物结合至BP时，诱导L与BP 的协同结合，得到传感器分子的闭合构型，其中巧光受体与Luc空间上紧密相邻，使高效的 BRET得W发生。
[0016] 本发明的传感器分子的特征包括蛋白质部分，所述部分包含连接至结合蛋白（BP) 的巧光素酶(Luc)，所述结合蛋白（BP)能结合所述感兴趣的分析物。
[0017] 本文所用Luc指能催化产能化学反应的巧光素酶，其中特异底物巧光素被氧化。各 种类型的生物体(原核和真核，包括细菌、藻类、真菌、昆虫、鱼和其他水生形式)可用该方法 发射光能量，其各具有特异巧光素酶活性和巧光素，它们与其他生物所具有的那些在化学 上不同。巧光素/巧光素酶系统在形式、化学和功能上非常多样化。例如，一些细菌和磨茹显 示有促进连续化学发光的巧光素酶活性;在腰鞭毛虫藻类中则是适于促进偶尔或同时诱导 发射的巧光素酶活性。作为化学能量转变为光能所带来的现象，生物发光并不限于活生物 体，也不需要存在活生物体。其仅是需要巧光素酶活性的化学发光反应的一种类型，其在一 个阶段或其他阶段时源于生物催化剂。因此，保存或构建必要的活性和化学足W产生生物 发光现象。还涵盖的是非天然产生的巧光素酶，例如突变巧光素酶。因此具有巧光素酶活性 的生物发光蛋白可获自各种来源或可通过各种方法获得。示例性的具有巧光素酶活性的生 物发光蛋白可获自美国专利号5,229，285; 5,219,737 ;5,843,746 ;5,196,524;或5,670， 356。优选的巧光素酶包括Reni 11a巧光素酶、蛋火虫巧光素酶和Gauss ia巧光素酶。
[0018] 在【具体实施方式】中，本发明的传感器包括前述化noLuc?巧光素酶(Nluc)，其为 19. IkDa，单体，ATP依赖性酶，采用新底物产生高强度，进行辉光型发光。参见W0 2012/ 061530和Hall等ACS Chem Biol.2012;7(11): 1848-57。所述酶用定向进化从深海邮巧光素 酶中生成，产生比其他形式的巧光素酶(包括蛋火虫(Photinus pyralis)和海肾巧光素酶） 更亮的巧光素酶。NanoLuc酶的高强度发光与复立玛津(furimazine)的低自发光的组合，得 到对低水平巧光素酶的灵敏检测。
[0019] 本发明的传感器分子中，巧光素酶融合至能结合感兴趣分析物的结合蛋白，W及 融合至分子内配体L"BP可为天然或非天然产生的分析物的蛋白结合伴侣。在一个实施方式 中，其为天然产生的结合伴侣或其功能性片段。还涵盖天然产生的结合蛋白的工程突变体 或其片段，例如通过环状排列（circular permutation)的工程突变体或其片段。
[0020] 如下述实施例所示，本发明的【具体实施方式】包括BP是天然产生的受体、酶、结合蛋 白或其片段的传感器分子。
[0021] 在另一实施方式中，BP是分析物的专口设计的非天然产生的结合伴侣。本领域已 知提供给定感兴趣分析物的结合蛋白的方法。例如，隧菌体展示技术可从含随机肤序列的 库中快速筛选结合蛋白候选物。例如，小分子的结合体已使用隧菌体展示从抗运载蛋白 (anticalin)支架的随机库中选取（Skerra阳BS J.2008年6月；275(11):2677-83)。已开发 并可等同使用许多其他支架例如硫氧还蛋白A、DARPins、单体(monobodies )、亲和体、抗体、 抗体的单链可变片段(scFv)及其他。对于选择技术也一样，隧菌体展示的替代示例包括核 糖体、酵母、mRNA或细菌展示W及酵母双杂交系统和酵母Ξ杂交系统。
[0022] 作为另一替代，BP是计算机设计的结合蛋白。例如，本领域已公开用于设计结合具 体配体的蛋白的常规计算机方法。参见Fleishman等Science2011; 332(6031 ):816-21和 Tinbe巧等化化re 2013(在印）。例如，提供BP是计算机设计的地高辛结合蛋白DIG10.3的传 感器（Tinberg等化ture 2013(在印）），其中传感器适用于检测地高辛、地高新或其他 DIG10.3 配体。
[002；3]例如，提供BP是(环状排列）二氨叶酸还原酶(DHFR)的传感器，其中传感器适用于 检测氨甲蝶岭或其他D!FR抑制剂。
[0024] 另一示例中，BP是碳酸酢酶或其片段，从而传感器可检测碳酸酢酶抑制剂、优选托 化醋(商品名Topamax)，其为抗惊厥(抗癒痛)药物。
[0025] 另一示例中，BP是检测免疫抑制分子雷帕霉素或相关大环内醋类他克莫司（旧称 FK506)的FK506结合蛋白（FKBP)，雷帕霉素或相关大环内醋类他克莫司用于治疗器官移植 后的患者、患有自身免疫素乱的患者W及癌症患者。
[0026] 在另