4个方面的技术措施，申请人解决了产油微藻开放池大规模培养所面临 的主要技术难题，建立了一套完整的、适合于产油微藻开放池大规模培养的工艺路线，并将 该工艺用于培养油球藻Graesiella sp.WBG-1生产生物柴油原料。利用该培养方法，在室外 200m2培养池培养油球藻Graesiella sp .WBG-1，油脂含量达到干重30%以上，生产的微藻 油脂适合于生物柴油的炼制。
[0019] -种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其步骤是：
[0020] 1、藻种的扩大培养：
[0021 ] 所使用的藻种是油球藻Graesiella sp.WBG-Ι，该藻种已于2015年8月14日保藏于 中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山），保藏编号为CCTCC N0: M2015486。油球藻Graesiella sp.WBG-1具有以下特征:细胞为球形至椭球形，直径8~12μ m，细胞中可见一蛋白核，色素体杯状，周生，细胞表面无鞭毛、突起等结结构。培养藻种从实 验室2000mL三角瓶开始，依次经过2000mL三角瓶、室外50L培养箱、室外5m 2培养池、室外20m2 培养池逐级扩大培养，得到足量的油球藻Graesiella sp.WBG-1藻种液。在室外光温条件下 逐级扩大培养的过程中，藻细胞逐步适应了自然光照与温度的变化，实验期间光照强度变 化范围0~2600ymol m-2s-\藻液温度变化范围20~35°C。
[0022] 2、反应器准备与配制培养基：
[0023] 室内2000mL三角烧瓶和培养用水（1000mL)经过121°C、20min湿热灭菌，冷却到室 温(20~25°C，以下相同）后，按照表1加入所需的母液，配制成培养基。
[0024]室外培养反应器(50L培养箱，5m2、20m2和200m2培养池）的准备包括清洗及表面消 毒两个过程，经过清洗和表面消毒的反应器中注入经过过滤的清洁培养用水，50L培养箱注 入40L水，5m2、20m 2和200m2培养池注入培养用水，使水深达到15-25cm。上述清洗用水和培养 用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10ym滤芯)过滤获得。根据注入的水量，按照表1加入所 需的母液，配制成培养基。
[0025]所用培养基成分见表1。除碳酸氢钠直接称量干粉配制培养基外，其他各组分先配 制成浓缩母液并煮沸消毒，再按所需数量添加到反应器中，得到所需培养基。当培养基体积 较大时(200m2开放池），硝酸盐、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙等亦可按照终浓度称量干粉加 入。硝酸盐可以是硝酸钠(NaN0 3)、硝酸钾(NaN03)、硝酸镁(Mg(N03)2)、硝酸钙(Ca(N0 3)2)等， 不同硝酸盐分子量不同，培养基组成中硝酸盐的浓度统一以硝酸根(MV)的浓度计量。 [0026]表1培养基组成及配制方法
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[0029] 3、接种与培养：
[0030] 按照藻种扩大培养所述，逐级扩大培养，反应器提前清洗、消毒并配制好足量培养 基，前一级培养为后一级培养提供藻种，接种时加入藻种液的体积不小于培养基体积的1/ 10，保证足够的接种量。
[0031] 室外50L培养箱以过滤除菌的压缩空气进行搅拌;开放式培养池以调速电机带动 叶轮搅拌器进行搅拌。培养过程中每天取样，监测藻液0D、生物质干重，并在显微镜下观察 细胞形态。
[0032] 对于藻种扩大培养，依据自然光照的强弱和温度的高低，培养时间在4~6天范围 内变化，待藻液0D值达到1.0以上，即可为下一级培养供应藻种。
[0033] 对于产油微藻的规模培养(200m2开放池，图1)，从接种到完成油脂的积累，整个培 养周期为12~18天。
[0034] 4、培养过程中藻液pH控制和C02供给：
[0035] 利用在线pH控制器(Jenco ΙΡ-600-9ΤΗ·ρΗ) -传感器(Jenco 6311)系统将藻液pH 控制在一定范围内。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧化碳而逐渐升高，当pH传感器检测 的藻液pH达到设定范围的上限时，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管 道流入安置在池底的微孔管状气体分散器，管状气体分散器的管壁上布满微孔，微孔的孔 径小于100微米，C0 2通过管壁上的微孔形成细小的气泡进入藻液，C02气泡在藻液中上升的 过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到设定值的下限，pH控制器切断二 氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被维持在一定的 范围内，同时，向培养液中补充碳源，供微藻光合作用使用。所述的pH为9.0~10.0范围内的 任意值。
[0036] 5、微藻的采收：
[0037] 200m2培养池培养结束时停止搅拌，藻液静置6小时以上，使细胞沉降到池底;上清 液从排水口自然排出，从而获得浓缩50倍以上的浓藻浆，再经过离心机脱水，采收生物质。 沉降浓缩-离心采收的采收工艺极大减少了离心水处理量，也相应地减少了能耗成本。 [0038]通过以上技术措施，以产油微藻油球藻Graesiella sp.WBG-Ι为藻种，经过逐级扩 大培养，接种到200m2开放式培养池，在自然光温条件下进行规模培养，利用pH在线控制系 统控制外源C0 2通入藻液，将藻液pH维持在9.0~10.0范围内的任意值，培养结束后，使藻液 静置，藻细胞自然沉降到池底，排出上清液，得到浓缩了 50倍以上的浓藻浆，再经过离心脱 水，藻泥的生物质干重达到25%以上；总脂含量平均达到生物质干重的31.55%，总脂产率 平均2.32g πιΛΓ1，中性脂占总脂的88.89%，对外源C02的利用率平均达到65.77%。
[0039]作为本发明的一个优选方案，2000mL三角瓶培养藻种时，光照强度设置为50~100 μπιο? πΓΥ1，温度范围25~30°C，再逐级扩大培养。
[0040] 作为本发明的一个优选方案，所述油球藻Graesiella sp.WBG-Ι在室外50L培养箱 及5m2、20m2、200m2培养池培养前，先用毛刷彻底清洗反应器内表面和搅拌器，再喷施84消毒 液(爱福特牌，有效氯l〇〇〇mg Γ1)对反应器内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将反应器内 表面、通气管和搅拌器冲洗干净，将反应器内积水排除干净后，向反应器中放入经过过滤的 清洁培养用水。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，10ym滤芯)过滤获 得。
[0041] 作为本发明的一个优选方案，所述步骤5中培养结束时关闭搅拌机，藻液静置过夜 (12小时以上），排出上清液后获得浓缩藻液，再以离心法采收生物质。
[0042]作为本发明的一个优选方案，当利用所述方法进行油球藻Graesiella sp.WBG-Ι 藻种液制备时，培养基中硝酸盐浓度（以硝酸根计）为0.073~0.219g I/1;当进行油球藻 Graesiella sp.WBG-Ι大规模开放式培养池(200m2)培养时，培养基中硝酸盐浓度（以硝酸 根计）为0.036~0.146g L一、
[0043]作为本发明的一个优选方案，利用200m2培养池培养时，培养液pH控制在9.0~ 10.0范围内的任意值，当培养液pH高于10.0时，用二氧化碳气体将pH调节到优选的范围。
[0044] 本发明与现有技术相比，其有益效果和优点在于：
[0045] 1、本发明建立了一套完整的、利用开放池分批培养产油微藻的方法，该方法经过 多次的开放式培养池培养验证，可操作性强、技术成熟、效果稳定。
[0046] 2、利用所述方法，在200m2培养池中培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，藻细胞油 脂含量达到33.42 %，其中88.89 %的组份为中性脂(三酰甘油TAGs)(图2 )，同时，脂肪酸以 C16及C18等适合于炼制生物柴油的脂肪酸为主，C16及C18总和占总脂肪酸量的75%以上 (图3)。相比于已有产油微藻开放式光自养培养的报道，本发明在更大规模(200m 2,40000L) 上获得了更高的油脂含量(总脂含量达到干重的30%以上），获得的微藻生物质适合于作为 微藻生物柴油的原料(见实施例3)。
[0047] 3、以外源C02为碳源培养产油微藻，⑶2利用效率达到65%以上(见实施例3)，在利 用烟道气c〇2为碳源培养产油微藻方面具有应用潜力。
[0048] 4、利用油球藻Graesiella sp.WBG-Ι细胞大(8~12μηι)、易沉降的特点，本发明采 用自然沉降浓缩、离心采收的工艺路线，藻细胞经过自然沉降，浓缩50倍以上，之后进行离 心处理的浓缩藻浆体积是原藻液体积的1/50以下（图4)，采收能耗大幅降低。
【附图说明】
[0049] 图1为一种室外200m2开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的培养现场 图。
[0050]图2为一种油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的总脂薄层层析图。薄层板基质为硅胶 GF254,上样量20-40yg，展层剂为正己烷/乙醚/乙酸=7/3/0.1，最后以碘蒸汽显色。图中最 大的椭圆斑点为中性脂TAG。
[0051 ] 图3为一种200m2开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的总离子流色谱 图。以含有〇. 5%NaOH的甲醇溶液对总脂提取物进行酯化，酯化样品气相色谱分离，质谱检 测。图中横轴为保留时间，纵轴为总离子流丰度，波峰处标示了对应的脂肪酸及其离子丰 度。
[0052]图4为一种油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的自然沉降。左边量筒中是混合均匀的藻 液，右边量筒是经过12小时静置的藻液，细胞全部沉降到量筒底部，液面高度约为30cm。
【具体实施方式】
[0053]根据下列实施例，可以更好的理解本发明专利。实施例中，所描述的培养基组成、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当限制权利要求书中所详细描述的本发明的 范围。
[0054] 实施例1:
[0055]产油微藻扩大培养包括2000ml三角瓶一 50L培养箱一 5m2培养池一 20m2培养池培养 (藻种扩大培养），一种开放式培养池规模培养产油微藻Graesiella sp.WBG-Ι的培养方法， 其步骤是：
[0056] (1)三角瓶及其培养用水准备：
[0057] 2000ml三角瓶及其培养用水（1000ml)经121°C、20min高温湿热灭菌，冷却至室温， 备用。
[0058] (2)50L培养箱及其培养用水的准备：
[0059]先用毛刷彻底清洗培养箱内表面，再喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯1 OOOmg Γ1) 对培养箱