内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将培养箱内表面冲洗干净，排出积水，将经过 煮沸消毒的通气管和砂芯气体分散器放入培养箱中，注入40L经过过滤的清洁水，接通气源 开始通气（气流量3L mirT1)，通入的气体为空气与⑶2的混合气体，C02的比例为1.0% (V/ V)，并经过〇.22μπι孔径滤膜过滤除菌。上述清洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，1 Ομπι滤芯)过滤获得。
[0060] (3)开放池及其培养用水准备：
[0061] 5m2、20m2培养池使用前，先用毛刷彻底清洗反应器内表面、搅拌器、C0 2气体分散器 和通气管等所有可能接触到培养液的物体表面，再喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯lOOOmg Γ1)对反应器内表面消毒，然后使用过滤的清洁水将反应器内表面、通气管和搅拌器冲洗干 净，将反应器内积水排除干净后，向反应器中放入经过过滤的清洁水，水深15-25cm。上述清 洗用水和培养用水均通过液体过滤器(HFL-0820，ΙΟμπι滤芯)过滤获得。
[0062] (4)培养基配制：
[0063] 按照表1所示的母液浓度分别配制6种浓缩母液，进行高压灭菌（12?Γ20π?η)后自 然冷却到室温备用；培养前，向已注入清洁培养用水的三角瓶或反应器（50L培养箱，5m2， 20m 2培养池）中按表1所示逐个添加浓缩母液及碳酸氢钠，使用硝酸钠为氮源。当配制培养 基体积较大时，硝酸钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾等药品按表1所示终浓度称量药品干粉 加入;每添加一种母液(或干粉)后充分搅拌，再添加另一种母液(或干粉），防止离子局部浓 度过高而沉淀。
[0064] (5)2000mL 三角瓶培养：
[0065] 2000mL三角瓶和培养基（约1000mL)准备好以后，取上一次培养的藻种液（约 300mL)加入2000mL三角瓶中，接种量控制在1/10以上，摇动三角瓶，使加入的藻种液与培养 基混合均匀，将接种好的三角瓶放置在培养架上，温度范围25~30 °C，光照强度控制在50~ 100μ mol π^?Γ1，光暗周期为14小时光照和10小时黑暗，每天人工摇动三角瓶4~6次，每天 向三角瓶中充1次C0 2(流量2L mirT1，每次0.5~1分钟），补充碳源同时控制藻液pH。培养4至 6天即可为50L培养箱提供藻种。
[0066] (6) 50L培养箱扩种培养：
[0067]将2000mL三角瓶中的藻种液接种到50L培养箱(含40L培养基）中，培养箱置自然光 照下培养。培养过程中连续通入空气与C〇2的混合气体，C〇2的比例为1.0% (V/V)，气体流量 为3.0L mirT1，通入的气体经过0.22μπι孔径滤膜过滤除菌。每天取样测定藻液光密度 (0D54 Qr?)，培养4至6天后藻液0D达到1.0以上，可用于下一级接种。
[0068] (7) 5m2培养池扩种培养：
[0069]将培养箱培养的藻液约100L接种到5m2培养池中，调节搅拌器转速为20rpm。每天 取样测定藻液光密度(0D54Qnm)，培养4至6天后藻液0D达到1.0以上，可用于下一步培养的藻 种。
[0070] pH控制和⑶2供给：利用在线pH控制器（Jenco IP-600-9TH.PH) -传感器（Jenco 6311)系统将藻液pH控制在9.0~10.0范围内的任意值。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧 化碳而逐渐升高，当pH传感器检测到藻液pH达到10.0，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二 氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔管状气体分散器形成细小的气泡进入藻液， C02气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到9.0，pH 控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被 维持在9.0~10.0范围内，同时，向培养液中补C0 2,为微藻光合作用提供所需的碳源。
[0071] (8) 20m2开放池池扩种培养：
[0072]将5m2培养池培养的藻液约400L接种到20m2培养池中，调节搅拌器转速为20rpm。每 天取样测定藻液光密度(0D54Qr?)，培养4至6天后藻液0D值达到1.0以上，可用于下一步接种。 [0073] pH控制和C02供给:与5m2开放池扩种培养中pH控制和C02供给方法相同。
[0074]利用上述藻种扩大培养方法，可获得足量藻种，能够满足200m2开放池培养生产的 需要。
[0075] 实施例2:
[0076] 不同硝酸盐培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι测定生物质产量和总脂含量。
[0077] 按照实施例1所述方法，在5m2培养池中进行油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养， 培养基深度20cm，接种后藻液的生物质干重控制为0.05g I/1。分别使用硝酸钠(NaN03)、硝 酸钾(KN〇3)、硝酸镁(Mg(N0 3)2)、硝酸钙(Ca(N03)2)4种氮源，不同硝酸盐的浓度统一用硝酸 根的浓度计量，全部为〇.〇73g I/1，每种硝酸盐重复培养3次，每次培养15天，培养过程中日 平均光照强度在21~37mol πιΛΓ1范围内，日平均水温在25~33°C范围内。
[0078] 培养过程中每天取样测定生物质干重，培养15天，然后将藻液静置6小时，藻细胞 自然沉到培养池底，将上清液排出培养池，剩下的浓藻液1500rpm离心10分钟采收生物质， 真空冷冻干燥获得藻粉。采用〇.45以111滤膜过滤法测定油球藻6抑6816113 8?.￥1^-1生物质 干重，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11) :80-85)测定细胞总脂含 量，结果见表2所示。
[0079] 表2不同硝酸盐培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的生物质产量和总脂含量
[0080]
[0081]表2所呈现的结果说明，利用四种硝酸盐(硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸钙)分别培 养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι，油球藻生物质产量、生物质产率、总脂含量和总脂产率均 没有显著差异(P<〇.05)，均可获得相同的效果。
[0082] 实施例3:
[0083] 不同初始氮源浓度培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι测定生物质产量和总脂含 量。
[0084] 按照实施例1所述方法，在5m2培养池中进行油球藻Graesiella sp.WBG-1的培养， 使用硝酸钠为氮源，设置3种初始硝酸钠浓度0.05g I/^O.lg Γ1和0.2g I/1，对应的硝酸根 浓度分别是〇.〇37g L-^0.0738 L-1和0.146g L-、培养基深度20cm，接种后藻液的生物质干 重控制为〇.〇5g I/1，每个硝酸钠浓度重复培养3次，每次培养15天，培养过程中日平均光照 强度在23~36mol ι?ΛΓ1范围内，日平均水温在25~32°C范围内。
[0085] 培养过程中每天取样测定生物质干重，培养15天，然后藻液静置6小时，藻细胞自 然沉到培养池底，将上清液排出培养池，剩下的浓藻液1500rpm离心10分钟采收生物质，真 空冷冻干燥获得藻粉。采用〇 · 45μηι滤膜过滤法测定油球藻Graes i e 11 a sp · WBG-1生物质干 重，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11) :80-85)测定细胞总脂含量， 结果见表3所示。
[0086] 表3不同初始硝酸钠浓度培养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的生物质产量和总脂 含量
[0087]
[0088]从表3可以看出，油球藻Graesiella sp.WBG-Ι的生物质干重随硝酸钠(氮源)浓度 的增加而增加，但总脂含量随着硝酸钠浓度的增加而降低。初始硝酸钠浓度O.lg I/1(硝酸 根浓度〇.〇73g Γ1)的总脂产率最高，达到3.03g πιΛΓ1;硝酸钠浓度降低为0.05g Γ1(硝酸 根浓度0. 〇37g I/1 )，总脂含量可进一步提高，但生物质产率下降幅度较大，因而总脂产率比 硝酸钠浓度O.lg Γ1有所降低;硝酸钠升高为0.2g I/1(硝酸根浓度0.146g I/1)后，生物质 产率得到一定程度的提高，但总脂含量仅为干重的25.08%，致使总脂产率低于硝酸钠浓度 O.lg L-1的总脂产率。此外，初始硝酸钠浓度为0.05g L-\0.1g L-\0.2g L-1时，培养结束时 的总脂含量比培养开始时的总脂含量分别提高了 89 %，70 %和52 %，表明油球藻 Graesiella sp.WBG-Ι在培养过程中具有显著的油脂积累。由此可见，在开放式培养池中培 养油球藻Graesiella sp.WBG-Ι生产生物柴油的原料，适宜的初始硝酸钠浓度范围是0.05 ~0.2g L-S最适初始硝酸钠浓度是O.lg L一、
[0089] 实施例4:
[0090] 200m2开放式培养池培养油球藻Graesiel la sp.WBG-1。
[0091] 200m2开放式培养池培养包括培养池准备、培养基配制、接种、培养和采收等步骤， 清洗培养池和配制培养基用水均经过液体过滤器(HFL-0820，ΙΟμπι滤芯)过滤。
[0092]培养池准备：向200m2开放式培养池中注入少量过滤水，用毛刷沾水仔细刷洗池 壁、池底、搅拌器叶片、c〇2气体分散器和通气管等所有可能接触到培养液的物体表面，不留 死角，之后排尽污水，再用过滤水冲洗2或3遍，然后将水排干；向池壁、池底、叶轮搅拌器等 接触培养液的表面喷施84消毒液(爱福特牌，有效氯lOOOrng Γ1)，连续喷施3次，然后用少量 过滤水将池壁、池底、叶轮搅拌器冲洗干净，排干。
[0093]培养基配制：向培养池中注入过滤水，水深20cm，开启搅拌器。使用硝酸钠为氮源， 硝酸钠浓度为〇. lg I/1，对应的硝酸根浓度为0.073g I/1。根据注水体积及表1所示培养基 组份终浓度计算出硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠等药品的需要量，称取干 粉逐个加入水中，硫酸亚铁-EDTA(母液5)及微量元素(母液6)仍配制成浓缩母液，按照培养 基体积及表1所示母液用量添加，每添加一种母液(或干粉)后充分搅拌，再添加另一种母液 (或干粉），防止离子局部浓度过高而沉淀。
[0094]接种及培养:将约4000L藻种液(20m2培养池培养)接种到200m2培养池中，调节搅拌 器转速为25rpm。每天取样测定藻液光密度(0D54Qnm)，同时测定藻液深度，培养15天。
[0095] 培养过程中pH控制及C02补充：利用pH控制器(Jenco ΙΡ-600-9ΤΗ·ρΗ) -传感器 (Jenco 6311)系统将藻液pH控制在9.0~1