一种顺序酶表面共展示系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体地说是一种顺序酶表面共展示系统及 其应用。
【背景技术】
[0002] 顺序酶传感器是指通过多种相关酶顺序、协调的完成一系列的催化反应。底物经 过两步酶的催化，生成最终产物和副产物，副产物一般具有化学或物理活性，可以转化为待 检测信号，根据检测信号从而确定底物的浓度。例如淀粉或麦芽糖经糖化酶（GA)水解产生 葡萄糖，葡萄糖再被葡萄糖氧化酶（G0D)氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，后者在电极 上可被氧化产生电流，实现其检测。顺序酶传感器的制备一般是通过化学交联、包埋等方法 将几种酶同时固定在电极上，由于不同的酶与交联分子的亲和性不一样，导致固定之后各 种酶之间的比例难以控制，检测结果的准确度易受影响。并且多种酶之间的空间位置和取 向不确定，固定之后酶的活性中心的分布呈现无序状态，影响总反应的速率。因此，传统的 顺序酶传感器普遍存在稳定性差、灵敏度低和互换性差的问题，这是制约顺序酶传感器发 展和应用的瓶颈。近几年，通过改善酶的固定方式，发展了多种双酶传感器，并一定程度上 提高了传感器的稳定性能。但是过度的化学交联会损失酶的活性，降低检测的效率。通过分 子水平操控，可以有效的保留酶固定时的活性并可以控制酶的空间位置，然而目前的研究 仅停留在单个酶分子上，对顺序酶传感器的改善效果微乎其微。发展一种多酶共展示体系， 有望提高顺序酶的稳定性，例如Zhou等人以麦芽糖传感器为研究对象，提出了融合蛋白的 解决方案，从基因水平进行分子操控，获得了 G0D-连接肽-GA的融合基因，在甲基营养酵母 中表达出了融合蛋白，实现了两种酶的比例控制，明显改善了麦芽糖传感器的性能，其不足 之处是该融合蛋白的构建方法复杂、效率低。发展一种更为简易的、多种酶比例可控的顺序 酶共展示全细胞，是解决顺序酶传感器瓶颈问题的关键。
[0003] 糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC. 3. 2. 1. 3, GA)，它能将淀粉、糊精 或寡聚糖从非还原性末端切开α-1，4葡萄糖苷键产生β-D-葡萄糖，也可以缓慢催化 α-1，6糖苷键产生葡萄糖。糖化酶广泛分布在微生物体内，例如真菌中的酵母、黑曲霉、 根酶、疏棉状嗜热丝孢菌等，细菌中的芽孢杆菌属、嗜热厌氧杆菌属、黄杆菌属等。来自于 Thermoanaerobacter tengcongensis中的GA具有很好的热稳定性能，最适反应温度为 75°C，在70°C放置6小时酶活基本没有变化。葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase, EC 1. 1. 1.47，GDH)可在辅酶的作用下催化葡萄糖成为葡萄糖酸内酯，不同的葡萄糖脱氢酶 利用的辅酶也不同，常见的有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP+)、吡咯喹啉醌（PQQ)和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)。将枯草芽孢杆菌中的GDH进行 定点突变，得到的突变体Q252L/E170R/V149K/G259A的热稳定性和特异性都很好，在60°C 和65°C条件下的半衰期分别是21天和3. 8天，对其他糖类，如木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、 蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、核糖和阿拉伯糖均无催化活性。上述的GA和GDH可以组成顺序酶 体系，底物淀粉或麦芽糖通过GA的作用生成葡萄糖，葡萄糖在辅酶NAD +作用下被GDH氧化， 辅酶NAD+被还原成NADH，后者在340nm处测定光吸收值来表示顺序酶总反应活性。
[0004] 微生物表面展示技术是指利用基因工程的手段将靶蛋白与锚定蛋白融合，从 而使其在宿主体内进行表达并展示在微生物细胞的表面，被展示的外源蛋白仍具有独 立的空间结构和相对完整的生物功能。能够展示复杂蛋白的锚定蛋白主要有自转运蛋 白（autotransporter proteins, ATs)、外膜蛋白（OMPs)和冰核蛋白（ice nucleation protein, INP)。INP被发现于欧氏杆菌、假单胞杆菌和黄单胞菌属。在过冷的水中，它能使 宿主细胞形成冰晶核。INP由N端结构域、C端结构域及中央结构域组成，其中N端结构域负 责锚定于细胞表面。为了满足不同酶促反应的要求，开发出了多个共展示系统，例如，各种 脂肪酶、有机磷水解酶等展示在了细胞的表面，并在生物催化和环境治理等方面得到了应 用。然而，在以上系统中多种酶是随机聚集在一起，酶的精确比例和顺序没有得到有效地控 制，这将会直接影响酶的催化效率。因此，如果能够得到一种酶的比例和顺序可控的系统， 那么多种酶就可以更加高效地利用底物进行级联反应，从而在最大限度上提高整体的催化 速率。
[0005] Cohesin-dockerin(Coh-Doc)是具有高度亲和力的一对蛋白，是纤维小体脚架 蛋白的主要组成部分。Coh-Doc的离解常数（K d)小于109M，而且不同的物种之间还存在 特异性，来自于一种菌株的cohesin仅能识别结合来自于该菌的dockerin或其与酶的 复合体，但不能结合来自于其它物种的dockerin。纤维小体是个非常复杂的纤维素酶系 统，这些酶与doc结构域进行融合，通过与非催化支架蛋白coh结构域之间高度的亲和 力而集合在一起。迄今已发现的Cohesin-dockerin模块主要存在于C. thermocellum、 C. cellulolyticum、A. celllolyticus 和 Clostridium acetobutylicum 中。到目前为止， 研究人员已利用Coh-Doc的相互作用在细胞表面展示并组装了多种酶复合物体系，整体的 酶促反应效率均有所提高。在细菌表面展示系统方面，研究人员在乳酸乳球菌表面构筑了 由两种不同类型Coh结构域组成的支架，葡萄糖醛酸酶和半乳糖苷酶与相应的doc结构域 融合后在大肠杆菌中进行胞内表达，纯化得到融合蛋白，并在乳酸乳球菌表面完成组装，实 验结果表明蛋白大小和相对位置会影响整个复合体的催化效率。酿酒酵母细胞本身可以 消耗葡萄糖进行新陈代谢产生乙醇，利用这一特点，研究人员采用a凝集素酵母细胞表面 展示系统构筑了纤维小体，实现了由纤维素直接生成乙醇。例如，Tsai等开发了小型支架 蛋白的酵母展示系统，由三个不同的Coh结构域组成，外切纤维素酶、内切葡聚糖酶和葡糖 苷酶这三种纤维素酶与相应的Doc结构域融合后在大肠杆菌中进行胞内表达，最后将酵母 细胞与大肠杆菌粗酶液进行孵育，从而完成纤维小体的组装，此系统可以实现对纤维素的 协同水解。Wen等构筑的酵母纤维小体可以发酵磷酸纤维素，乙醇产量高达1.8g/L。除 此之外，研究人员将三种脱氢酶通过cohesin-dockerin的相互作用按照一定的顺序组装 起来，展示在酵母的表面，NADH的产生效率提高了 5倍。以上共展示系统的构建均基于 cohesin-dockerin的相互作用将多种酶按照1:1的比例展示在酵母等细胞的表面，然而， 关于顺序酶按照其他比例共展示系统的开发还没有报道。另外，以上研究主要用于乙醇的 生产，在生物分析方面的研究甚少，因此利用顺序酶按比例共展示系统来研发顺序酶传感 器具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种顺序酶表面共展示系统及其应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种顺序酶表面共展示系统，顺序酶表面共展示系统为编码目标蛋白糖化酶的基 因序列（ga)、葡萄糖脱氢酶突变体的基因序列（gdh-m)和cohesin-dockerin蛋白的基因序 列（coh-dock)以及负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N。
[0009] 所述展示系统为按任意个数比将编码目标蛋白糖化酶和葡萄糖脱氢酶突变体展 示于细菌表面。
[0010] 优选是，糖化酶与葡萄糖脱氢酶突变体的个数比为1-20:20-1 ;
[0011] 进一步的优选是，糖化酶与葡萄糖脱氢酶突变体的个数比为ι-ιο:ιο-ι;
[0012] 再进一步的优选是，糖化酶与葡萄糖脱氢酶突变体的个数比为1-5:5-1 ;
[0013] 最优选的是，糖化酶与葡萄糖脱氢酶突变体的个数比为1 :1或2:1。
[0014] 所述编码目标蛋白糖化酶的基因序列ga来源于Thermoanaerobacter tengcongensis，从载体pET42b/ga中获得；编码目标蛋白葡萄糖脱氢酶突变体的基因序列 gdh-m来源于枯草芽孢杆菌，从载体pTInaPb-gdh中获得；
[0015] 编码冰核蛋白的基因与编码CohC、CohT两个支架蛋白的基因融合，连接到表达载 体pET_28a(+)上，转化至大肠杆菌表达，通过冰核蛋白的锚定作用，将支架蛋白展示在大 肠杆菌表面。
[0016] 所述将糖化酶与DocC蛋白融合、葡萄糖脱氢酶突变体与DocT蛋白融合，在大肠杆 菌胞内表达。
[0017] 所述cohesin-dockerin蛋白的基因序列中编码docker in蛋白的基因为，
[0018] 以菌株 Clostridium cellulolyticum H10 和 Clostridium thermocellum ATCC27405 的基因组 DNA 为模板，DocC-F/DocC-R 与 DocT - F/DocT-R 为引物，进行 PCR 扩 增，得到编码docker in蛋白的基因片段docc与doct,引物是DocC-F (5 ' 一 3 '）： ACGCGTCGA CACAGATCCTGACCCAGTAATTG 和 DocC-R(5' - 3'）：CCGCTCGAGGGTAAGTAAGCTTCCAAGCAAC ;Doc T-F (5 ' - 3 '）： CATGCCATGGACACTAAATTATACGGCGACGTC 和 DocT-R (5 ' - 3 '）： CGCGGATCCGTTCTT GTACGGCAATGTATC。
[0019] cohesin-dockerin蛋白的基因序列中编码cohesin蛋白的基因为，
[0020] 以菌株 Clostridium cellulolyticum H10 和 Clostridium thermocellum ATCC27405的基因组DNA为模板，CohC-F/CohC-R与CohT-F/CohT-R为引物，进行PCR扩增， 得到编码dockerin蛋白的基因片段cohc与coht,
[0021] 引物是 CohC-F (5 ' 一 3 '）：
[0022] ATCCCTGGCGATTCTCTTAAAGCGCGGATCCATCCCTGGCGATTCTCTTAAAG
[0023] 和 CohC_R(5, 一 3,）：
[0024] TTGAGTACCAGGATCTATAGTTACACATAAGAATGCGGCCGCAGGTGTTGTAGGT