耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌及复合微生物菌剂和制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌及复合微生物菌剂。
【背景技术】
[0002] 近20年在北方地区温室大棚蔬菜得到迅猛的发展，但是在生产过程中多数菜农忽 视了温室大棚内土壤的管理。在追求温室大棚蔬菜优质、高产、高效的目标下，努力提高复 种指数，盲目增加施肥数量和次数。例如在山东寿光蔬菜温室大棚在栽培过程中生鲜畜禽 粪便施用量一般在90-150m 3/hm2，最高超过200m 3/hm2;化肥投入量一般在7500kg/hm2左右， 远远超出蔬菜的吸收量。大量的含氮化肥和有机肥料分解产物在好氧条件下经硝化作用转 化为硝态氮积累在土壤中，导致大棚土壤中硝态氮含量急剧上升。同时由于温室大棚中缺 少雨淋，表层积盐不能淋洗到土壤深层，加上温室大棚中温度高，土壤中的盐分随着水的蒸 腾作用向土壤的表层聚集。在温室栽培条件下，土壤盐渍化的主要特点之一是硝酸盐积累。 研究表明温室表层土壤中的硝酸根约占阴离子总量的67-76%，最高达到0.66g/kg 硝酸根离子的大量积累不仅造成温室大棚土壤的盐渍化，而且NO厂强酸性阴离子在全 盐含量中所占比例大幅上升导致温室大棚的土壤pH值下降。随着温室大棚种植年限的增 加，土壤的pH也不断降低。北方一些蔬菜大棚土壤pH值由原来的7-8降低到4-5,导致大棚土 壤的理化性质和生物活性恶化，病虫害严重发生，蔬菜品质和产量显著下降。
[0003] 目前针对我国设施栽培大棚土壤盐渍化和酸化的情况，采取了一些治理措施，如 灌水洗盐，土壤改良剂法等方法。虽然这些方法有不少优点，但也存在很大的不足:灌水洗 盐会把硝态氮淋洗到地下，污染地下水;土壤改良剂法成本比较高，且多利用化工原料或工 业废弃物作为原料，也产生了土壤复酸化、重金属污染等问题。
[0004] 对现有技术的检索发现申请号为201510471378.4的中国发明专利申请公开了"一 种能改良酸化土壤的肥料添加剂"。其主要成分主要包括：蒙脱石粉、泥炭土、淤泥、落叶碎 末、石榴皮、双氰胺、硫脲、活性炭、果渣、贝壳粉、硅钙粉、木质素、EM菌剂、枯草芽孢杆菌菌 剂、复配除臭剂。可将甘蔗种植地土壤PH由4.6提高到5.7。但其使用的EM菌、枯草芽孢杆菌 并未经过针对大棚酸性土壤特别筛选，其对土壤中硝酸盐氮的反硝化或分解效果不明。该 发明改善土壤pH的有效成分主要是蒙脱石粉这一天然矿物，通过水解产生的氢氧根离子中 和土壤中的酸根离子。随着氢氧根离子的消耗，其改善土壤pH的效果并不持久。而且现有技 术不适合用于设施大棚土壤的改良，在于蒙脱石粉水解产生的Al、Mg阳离子又会加重土壤 的积盐的程度。
[0005] 申请号为201310512371.3的中国发明专利申请公开了一种"硝酸盐同化细菌及其 在修复设施次生盐渍化土壤中的应用"。通过硝酸盐同化细菌巨大芽孢杆菌NCT-2以土壤中 硝态氮作为氮源，并将其同化为其它形态的无机氮或细胞组分，从而实现对硝态氮的降解 转化、降低土壤中硝态氮含量并对土壤进行修复。NCT-2要针对轻度盐渍化土壤，其在 100mg/kg 土壤中硝态氮转化率可达98.4%，但在200mg/kg 土壤中硝态氮转化率仅为45.5%。
[0006] 现有技术提供的反硝化枯草芽孢杆菌制剂主要针对水体的硝酸盐除氮，水体一般 接近中性或微碱环境。例如CN02147874.0公开了一株好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂的制备 方法。其对虾塘水体中的亚硝酸盐进行反硝化去除，该枯草芽孢杆菌菌株的培养及应用pH 为7.0-9.0之间。又如0呢01510405040.9公开了一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂的制备 方法用于去除虾塘水体中亚硝酸盐。其菌株的培养和应用pH为7.0-8.0。我们知道强酸会造 成碱性蛋白质的功能团被中和并被降解，使蛋白质变性。因此没有针对低pH条件进行优化 筛选的菌株，在低pH环境中活性会明显降低甚至死亡。这些好氧反硝化枯草芽孢杆菌菌株 并不能适应北方温室大棚土壤的低pH环境(pH低至4.0)。经试验对比，市售用于水体的反硝 化枯草芽孢杆菌制备的复合微生物菌剂在温室大棚土壤中的反硝化氮去除率只有53%，远 低于本发明提供的复合微生物菌剂硝酸盐氮去除率98%。
【发明内容】
[0007] 本发明针对北方温室大棚硝酸盐积累产生的高酸度和盐渍化环境，通过紫外诱变 选育的耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌具有高效去除北方温室大棚土壤中的硝酸根的能力。
[0008] 为实现上述目的，本发明公开了一种耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌，所述菌株生物 学分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacillus subtilis，鉴定参椐编号KD203-3,所 述菌株已于2015年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为 CGMCC No.11624。
[0009] 保藏编号为CGMCC No. 11624的耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌通过下述步骤从土壤 中筛选、诱变选育而得： 1.反硝化出发菌株的分离纯化 通过系列稀释平板法以PH4.0的牛肉膏蛋白胨硝酸盐固体培养基从临淄10年棚龄的酸 化和盐渍化土壤中挑选单菌落。用PH4.0的硝酸盐葡萄糖反硝化液体培养基培养单菌落，分 别使用格里斯(Griess)试剂和二苯胺试剂检测硝酸盐葡萄糖培养基中硝态氮还原情况，在 反硝化能力强的菌株培养液中再检测硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的浓度，最终筛选出耐酸反硝 化能力强的野生型出发菌株KD203。
[00? 0]所述的牛肉膏蛋白胨硝酸盐培养基为:5g牛肉浸膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、lg硝酸 钾、20g琼脂，1000mL蒸馏水。
[0011]所述的硝酸盐葡萄糖反硝化培养基为：5g葡萄糖、2g硝酸钾、lgKH2P〇4、lgK2HP〇4、 0 · 20gMgS〇4.7H20、1 OOOrnL 蒸馏水。
[0012] 2.野生型出发菌株的诱变筛选 将野生型出发菌株KD203接种到pH4.0的牛肉膏蛋白胨硝酸盐液体培养基，30 °C条件 下，转速120rpm，培养24h，获得菌浓度在101()个/ml以上的菌液。取菌液50ml，离心，收集菌 体。在菌体中加入无菌水制备等体积菌悬液，分装成5个平皿，用紫外线照射各皿。紫外灯功 率20w，平皿离紫外灯距离20cm，照射时间为60s。将处理液稀释至每毫升含10 2-104个菌数， 每个稀释度取0.1ml涂平板，30°C恒温培养24h。挑选突变单菌落，分别检测突变菌株在 PH4.0条件下的反硝化能力，经筛选获得诱变菌株KD203-3,即得到保藏号为CGMCC No . 11624的枯草芽孢杆菌。该诱变菌株KD203-3能在30 °C，转速120rpm条件下，培养4d，对 PH4.0的硝酸盐葡萄糖反硝化液体培养基中硝酸盐氮的去除率达到88%。
[0013] 对本发明的枯草芽孢杆菌KD203-3在形态、16S rDNA基因序列和生理生化方面进 行鉴定。
[0014] 试验1:对耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌KD203-3的形态进行鉴定。
[0015]将枯草芽孢杆菌KD203-3接种于LB培养基上，培养24小时后的培养性状为:枯草芽 孢杆菌KD203-3产生芽孢，芽孢大多数为近端生、少数为中生，孢子囊膨大不明显;LB(细菌 基础培养基)培养基平皿上菌落呈不规则圆形状、表面不平整、乳白色、膜质，不透明、表面 暗色。
[0016] 经革兰氏染色，枯草芽孢杆菌KD203-3的形态为:革兰氏阳性，杆状、两端钝园，少 数呈不同程度链状排列。
[0017] 实验2:对枯草芽孢杆菌KD203-3的16S rDNA基因序列进行鉴定。采用天根生化科 技(北京)有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA作 为模板。扩增引物为通用引物，将PCR(聚合酶链反应)产物送宝瑞通生物技术(北京)有限公 司测序分析。将测序结果进行同源性比较，比较结果表明，枯草芽孢