杆菌KD203-3的菌株属 于枯草芽孢杆菌。
[0018] 本发明还提供了一种复合微生物菌剂，其特征是它包括如下组分且组分之间的体 积比为:保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢杆菌:放线菌:和绿色木霉=6:3:1。
[0019] -种复合微生物菌剂的制备方法，其特征是它包括如下步骤： (1)保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢杆菌以摇瓶培养、种子罐发酵和发酵罐发酵 获得活菌菌数为lxlO9个/ml的耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌KD203-3菌液。
[0020] (2)放线菌和绿色木霉采用市售菌株，分别发酵扩培，分别获得放线菌菌液和绿色 木霉菌液。放线菌菌液和木霉菌菌液中活菌菌数分别为lxlO 9个/ml。
[0021] (3)组分之间的体积比为:保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢杆菌:放线菌:绿 色木霉=6:3:1。按上述体积比将三者混匀，即得到本发明所述的复合微生物菌剂。
[0022] 本发明的有益效果是:本发明通过紫外诱变筛选出针对北方冬暖大棚氮肥施用量 过多导致硝酸盐积累产生的土壤盐渍化和酸化的高效耐酸反硝化的保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢杆菌，对含量达500mg/kg土壤中硝酸盐氮去除率达到90%以上。由耐酸 反硝化的保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢杆菌为主成分，配以放线菌、绿色木霉制备 的复合微生物菌剂，在北方温室大棚土壤中存活率和生物活性更高，对土壤的积盐量、理化 性质、生物活性都有极大的改善。本发明提供的微生物菌剂通过优化微生物菌种的配比，以 耐酸反硝化枯草芽孢杆菌对温室大棚酸化、盐渍化土壤的极强的适应能力和生物活性，可 以高效的去除温室大棚土壤的硝酸根积累，改善土壤微环境下的pH值和积盐含量，可以提 高配伍菌种一一放线菌和绿色木霉在温室大棚土壤中的存活率和生物活性，增加土壤中的 微生物的生物活性和生物酶活性，提高土壤生物肥力。
[0023] 针对设施大棚土壤酸化和盐渍化伴生的形成原因，特别选育的耐酸反硝化的枯草 芽孢杆菌KD-203可同时适应土壤的高盐高酸度环境，活性高。能够长效改善土壤pH和盐渍 化。施用本发明的微生物菌剂可以使土壤pH提高到更加适宜作物生长的pH条件，使硝酸盐 氮含量降低65.01%，使大棚土壤更加适合农作物的生长。由于耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌 对土壤微环境下理化性质的改良（pH和高盐环境），提高了施用微生物菌剂中微生物的存活 率和生物活性。故施用本发明微生物菌剂可使土壤中细菌、真菌、放线菌的数量分别提高 142.8%、77.6%、117.7%，同时使土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶活性分别提高了76.9%、52.7%、 50.8%，极大地提高了土壤生物活性，对大棚土壤的改良有极大的改良效果。由此可见，以选 育的耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌为主成分，辅以放线菌、绿色木霉制成的复合微生物菌剂 在北方温室大棚土壤中活性更高，对温室大棚盐渍化、酸化土壤具有良好修复效果，明显改 善大棚土壤的生物活性和理化性质。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:所述耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌菌株KD203-3通过下述步骤从土壤中筛 选、诱变选育而得： 1.反硝化出发菌株的分离纯化 选定淄博市临淄区种植10年温室大棚，取深层(5-15cm) 土壤约300g。称取10g刚采集的 新鲜土壤放入装有90mL无菌水的锥形瓶(装有若干玻璃珠）中，制成稀释度为ΠΓ1的土壤悬 液。另取7支装有9mL无菌水的试管取无菌移液管，依次制成稀释度为ΚΓ 4-10-54?0-64?0-7 -10 8土壤稀释液。
[0025] 配置ρΗ4.0的牛肉膏蛋白胨硝酸盐固体培养基，于1.05kg/cm2、20min灭菌后无菌 条件下倒入灭过菌的培养皿，制备成平板备用。牛肉膏蛋白胨硝酸盐培养基为：5g牛肉浸 膏、l〇g蛋白胨、5g氯化钠、lg硝酸钾、20g琼脂，1000mL蒸馏水。
[0026]以无菌移液管加入O.lmL制好的土壤稀释液(稀释度分别为10-5、10-6、10- 7、10-8)， 用无菌玻璃刮刀将土壤稀释液在平板表面涂抹均匀;将平板倒置于30° C恒温生化培养箱中 培养2-3天。
[0027]用灭过菌的接种环从平板上挑选单菌落接种于装有5mL、pH4.0的硝酸盐葡萄糖反 硝化液体培养基的试管中，置于30° C、100r/min下恒温振荡培养3天。硝酸盐葡萄糖反硝化 培养基为：葡萄糖5g，硝酸钾2g，磷酸二氢钾lg、磷酸一氢钾lg，七水硫酸镁0.20g，蒸馏水 1000mL〇
[0028] 培养结束后，在各试管中滴加1-2滴格里斯(Griess)试剂以检测是否有亚硝酸盐 的存在，若培养液马上呈粉红色或棕色，说明硝酸盐被还原成亚硝酸盐，该溶液中存在具有 好氧反硝化作用的细菌。若无粉红色或棕色出现，则进一步滴加二苯胺试剂，培养液若呈蓝 色，则表示培养液中硝酸盐未被转化，溶液中无具有反硝化作用的细菌。若无色，则表示硝 酸盐和新形成的亚硝酸盐都已还原成氨氮氧化物或氮气，该培养液中存在具有较强好氧反 硝化作用的细菌。
[0029] 在上述试管中鉴别出具有好氧反硝化作用的细菌后，将试管中菌液接种到pH4.0 硝酸盐葡萄糖反硝化平板表面涂布均匀，30°C恒温生化培养箱中培养2-3d后分离单菌落， 于PH4.0硝酸盐葡萄糖培养基斜面留存备用。
[0030] 用灭过菌的接种环分别从筛选出的具备一定反硝化能力的单菌落斜面上取一环 菌种回接到装有l〇〇mL灭过菌的pH4.0硝酸盐葡萄糖反硝化液体培养基的250mL锥形瓶中， 置于30°C、100r/min下恒温振荡培养4d。测定培养液中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的浓度，最终 筛选出耐酸反硝化能力强的野生型出发菌株KD203。
[0031] 2.野生型出发菌株KD203的诱变筛选 将野生型出发菌株KD203接种到装有100mL灭过菌的pH4.0牛肉膏蛋白胨硝酸盐液体培 养基的250mL锥形瓶中，于30°C、120r/min下恒温培养24h，获得菌浓度在109个/ml以上的菌 液。
[0032]取菌浓度在109个/ml以上的菌液50ml，离心，收集菌体。用无菌水制备等体积菌悬 液，分装成5个平皿，用紫外线照射各皿。紫外灯功率20w，平皿离紫外灯距离20cm，照射时间 为60s。将处理液稀释至每毫升含10 2-104个菌数，每个稀释度取0. lml涂平板，30°C恒温培养 2-3d。挑选突变单菌落，分别接到装有lOOmL灭过菌的pH4.0硝酸盐葡萄糖反硝化液体培养 基的250mL锥形瓶中，置于30°C、100r/min下恒温振荡培养2d。测定培养液中硝酸盐氮和亚 硝酸盐氮的浓度，分别检测突变菌株在PH4.0条件下的反硝化能力，筛选获得pH4.0条件下 反硝化能力最强的诱变菌株耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌KD203-3。
[0033]实施例2:耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌KD203-3反硝化能力检测 为检测耐酸反硝化枯草芽孢杆菌KD203-3在不同pH条件下的反硝化能力，挑选耐酸反 硝化枯草芽孢杆菌KD203-3菌株单菌落一环，分别接到装有lOOmL灭过菌的pH4.0-7.5五个 pH梯度的硝酸盐葡萄糖反硝化液体培养基的250mL锥形瓶中，置于30°C、120r/min下恒温振 荡培养4d。
[0034]实验表明，经紫外诱变的耐酸反硝化枯草芽孢杆菌菌株KD203-3在硝酸态氮含量 277mg/L pH4.0-7.5条件下，除氮率最低为88.35%，最高为100%。具体结果如表1示： 表1:
实施例3:本发明提供了一种复合微生物菌剂，以耐酸反硝化的枯草芽孢杆菌KD203-3 为主成分，辅以放线菌、绿色木霉制成。选取连续种植番茄的十年大棚，布置正交试验，每个 处理重复3次，30天后取土表层20cm进行混匀，土样进行预处理后测定PH、硝酸盐氮含量、土 壤生物量和酶活指标测定。CK为空白对照。
[0035]试验结果表明，组分之间的最佳体积比为:保藏号为CGMCC No. 11624的枯草芽孢 杆菌:放线菌和绿色木霉=6:3:1