eal-time PCR检测。结果如图7-(3)所示，检测灵敏度可达 10%突变样本。
[0067]实施例9: ASPCR方法检测L210W位点的特异度和灵敏度
[0068] (1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、L210W位点突变型质粒为模板，利用L210W位点 野生型扩增引物3即1[)勵.15和3四 1[)勵.21进行^￡11-^邮？0?检测。结果如图8-(1)所 示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
[0069] (2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、L210W位点突变型质粒为模板，利用L210W位点 突变型扩增引物SEQIDN0.16和SEQIDN0.21进行real-timePCR检测。结果如图8-(2)所 示，该引物对特异性扩增L210W位点突变型序列。
[0070] (3)以L210W位点1%-10%突变样本为模板，利用L210W位点突变型扩增引物SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.21进行real-time PCR检测。结果如图8-(3)所示，检测灵敏度可达 10%突变样本。
[0071 ]实施例10:ASPCR方法检测T215Y位点的特异度和灵敏度
[0072] (1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215Y位点突变型质粒为模板，利用T215Y位点 野生型扩增引物3即1[)勵.17和3四 1[)勵.21进行^￡11-^邮？0?检测。结果如图9-(1)所 示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
[0073] (2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215Y位点突变型质粒为模板，利用T215Y位点 突变型扩增引物SEQIDN0.18和SEQIDN0.21进行real-timePCR检测。结果如图9-(2)所 示，该引物对特异性扩增T215Y位点突变型序列。
[0074] (3)以T215Y位点1%-10%突变样本为模板，利用T215Y位点突变型扩增引物SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.21进行real-time PCR检测。结果如图9-(3)所示，检测灵敏度可达 10%突变样本。
[0075]实施例11 :ASPCR方法检测T215F位点的特异度和灵敏度
[0076] (1)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215F位点突变型质粒为模板，利用T215F位点 野生型扩增引物SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.21进行real-time PCR检测。结果如图10-(1) 所示，该引物对特异性扩增HIV-1野生型序列。
[0077] (2)分别以HIV-1野生型克隆质粒、T215F位点突变型质粒为模板，利用T215F位点 突变型扩增引物SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.21进行real-time PCR检测。结果如图10-(2) 所示，该引物对特异性扩增T215F位点突变型序列。
[0078] (3)以T215F位点1 % -10 %突变样本为模板，利用T215F位点突变型扩增引物SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.21进行real-time PCR检测。结果如图10-(3)所示，检测灵敏度可达 10%突变样本。
【主权项】
1. 一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，其特征 在于，包括检测 HIV-ι 病毒 pol 基因的突变位点 M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、 L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突 变型PCR扩增引物，每对野生型PCR扩增引物或突变型PCR扩增引物均包括一条特异性上游 引物和一条通用下游引物； 对于M41L位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID N0.1和 SEQIDN0.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQIDN0.2和SEQID NO.21； 对于D67N位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.21； 对于K65R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.21； 对于K70R位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.7和 SEQ ID NO.21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.21； 对于K70E位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO.21； 对于M184V位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 11和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO.21； 对于M184I位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 13和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO.21； 对于L210W位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 15和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO.21； 对于T215Y位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 17和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO.21； 对于T215F位点，其野生型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 19和 SEQ ID NO. 21，其突变型PCR扩增引物的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO.21〇2. 权利要求1所述的引物在检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点 中的应用，其特征在于，所述的耐药突变位点为M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、 L210W、T215Y和T215F。3. 权利要求1所述的引物用于检测HIV-1病毒NRTI耐药突变位点M41L、D67N、K65R、 1(701?、1(7(^、]\1184￥、]\11841、1^101、1215￥和1215?的43?〇?检测方法，其特征在于，具体步骤 为:将耐药突变位点相应的引物以待检测样品的cDNA为模板进行PCR扩增，实时rea 1 -time PCR检测的反应体系共20uL，其中2X SYBR Green PCR Master Mix 10uL，上游引物和下游 引物各0.4uL，待检样品cDNA模板2uL，ddH20 7.2uL;反应程序为:①预变性95 °C lmin，②然 后95 °C lOsec，退火62°C 30sec，延伸72 °C lmin，重复40个循环，③以每5秒升高0.5°C的速度， 从60°C升至95°C，获得产物的特异性溶解峰;根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数 CT值判定结果，当CT值小于等于33时，待测样品中含有扩增引物对应的基因型，当CT值大于 35时，待测样品中不含扩增引物对应的基因型。
【专利摘要】本发明涉及一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，包括检测HIV-1病毒pol基因的突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突变型PCR扩增引物，每个突变位点引物对的特异上游引物分别为SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.20，通用下游引物为SEQ？ID？NO.21。所述的引物用于检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变位点，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点。
【IPC分类】C12N15/11, C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105624333
【申请号】CN201610123551
【发明人】叶力, 梁浩, 蒋俊俊, 陈荣凤, 梁冰玉, 黄颉刚, 臧宁, 周波, 李旭, 韦吴迪, 刘洁, 赵芳凝
【申请人】广西医科大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月4日