用于检测和定位猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒的探针以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子病毒学领域，特别是涉及一种用于检测和定位猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒的探针以及试剂盒。
【背景技术】
[0002]牛病毒性腹湾病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病毒性腹湾/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)的病原，自 20世纪中期Olaf son等在美国描述并鉴定以来，现已广泛分布于澳大利亚、新西兰、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲等养牛发达国家。20世纪80年代初我国首次在由国外引进的绵羊、奶牛和冻精中分离出BVDV ο BVDV感染牛以后，其临床症状可表现为黏膜病、腹泻、母畜流产、产死胎和畸形胎等，给养牛业造成了很大的经济损失。2008年我国农业部公告第96号将牛病毒性腹泻定为三类疫病，世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病及国际动物胚胎交流病原名录三类疫病。
[0003]BVDV和猪瘟病毒(CSFV)同属黄病毒科瘟病毒属成员，BVDV除侵害牛引起BVD外，还可感染猪、绵羊、山羊以及其他反刍动物。猪感染BVDV不表现牛病毒性腹泻的临床症状而呈亚临床感染，其症状和病理变化类似温和型猪瘟，并可产生CSFV的交叉中和抗体，这给常规的血清学诊断带来一定困难，同时猪感染BVDV产生的抗BVDV抗体对CSFV有一定的抑制作用，因此猪感染BVDV后对猪瘟疫苗的免疫有干扰，会降低猪瘟疫苗的免疫效果。中华人民共和国兽用生物制品规程中明确规定猪瘟活疫苗成品应严格检验是否有外源病毒BVDV的污染。
[0004]当前国内外致力于BVDV在各器官中的检测和定位情况研究，但是电子显微镜和免疫荧光方法只能检测成熟病毒粒子，而无法定位病毒RNA，而且检测灵敏性低无法实现精确定量;Realtime RT-PCR方法虽然能对BVDV RNA总量进行检测，但是无法在细胞或亚细胞水平上进行BVDV RNA定位。因此，上述方法均未能有效获得BVDV RNA复制和增殖变化的详细动态过程。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于检测和定位猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒的探针以及试剂盒，本发明具有高敏感性和稳定性的特点，克服了传统荧光原位杂交法信号基团强度低，检测灵敏度差的技术问题。
[0006]基于上述目的，本发明提供的用于检测和定位猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒的探针包括4条针对牛病毒性腹泻病毒的特异性探针序列:
[0007]P1:5 ’-ATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATCACAAAT-3’；
[0008]P2:5 ’-AGGTGGGTCCATAATAGGCTTGACTGCCCTCT-3’；
[0009]P3:5 ’-ATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGA-3’；和
[0010]P4:5 ’-GCTTCTTGGTACGGGGAGGAGGAAGTCTACGGTATGCCA-3，。
[0011]在本发明的一些实施例中，所述4条针对牛病毒性腹泻病毒的特异性探针都标记红色荧光基团。
[0012]在本发明的一些实施例中，所述红色荧光基团选自Cy3基团、ROX基团、Texas Red基团和LC RED640基团中的至少一种。
[0013]在本发明的一些实施例中，还包括I条针对猪内参基因β-actin的特异性探针序列:
[0014]5’-ATGGAATCCTGTGGCATCACGAAACTACCTTCAACTCA-3’
[0015]在本发明的一些实施例中，所述针对猪内参基因β-actin的特异性探针标记绿色荧光基团。
[0016]在本发明的一些实施例中，所述绿色荧光基团选自FAM基团或者FITC基团。
[0017]在本发明的一些实施例中，所述探针基于QuantiGene ViewRNA技术，用于检测和/或定位牛病毒性腹泻病毒RNA。
[0018]本发明还提供一种试剂盒，包括上述用于检测和定位牛病毒性腹泻病毒的探针。
[0019]从上面所述可以看出，本发明提供的用于检测和定位牛病毒性腹泻病毒的探针以及试剂盒可用于对猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒进行检测和定位，尤其适用于基于QuantiGene ViewRNA原位杂交技术的检测。本发明基于QuantiGene ViewRNA技术的新型BVDV RNA原位杂交检测技术，能够特异、敏感、快速、简便地从培养细胞、组织和临床样本中对目标RNA进行检测和定位，可以清晰地可视化检测和定位BVDV RNA，从而在核酸水平上对BVDV感染过程中病毒RNA的复制、增殖规律进行阐述。
【附图说明】
[0020]图1为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测建立的结果图，其中红色亮点为BVDV RNA染色结果;绿色亮点为β-actin染色结果;蓝色亮区为细胞核染色结果；
[0021]图2为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测CSFV、PCV2、PRV以及BVDV的特异性的结果图；
[0022]图3为使用BVDV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测法和BVDV单抗免疫荧光法进行检测的结果图；
[0023]图4为采用本发明实施例的探针进行多次重复原位杂交检测建立的结果图。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
[0025]近年来，QuantiGene ViewRNA技术在重大人类疾病如癌症和艾滋病研究中均有应用，对这些疾病致病机理的研究提供了可靠的佐证，但在兽医病原微生物的检测方面鲜有报道，本发明是首次将该技术应用在猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒的检测和定位中。作为本发明的一个实施例，本发明提供的用于检测和定位牛病毒性腹泻病毒的探针包括4条针对牛病毒性腹泻病毒的特异性探针序列:
[0026]Pl:5 ’-ATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATCACAAAT-3’；
[0027]P2:5 ’-AGGTGGGTCCATAATAGGCTTGACTGCCCTCT-3，；
[0028]P3:5，-ATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGA-3，；和
[0029]P4:5 ’-GCTTCTTGGTACGGGGAGGAGGAAGTCTACGGTATGCCA-3’。
[0030]该套探针可用于对猪瘟外源病毒牛病毒性腹泻病毒进行检测和定位，尤其适用于基于QuantiGene ViewRNA原位杂交技术的检测。
[0031 ]作为本发明的一个实施例，采用本发明的探针进行检测和定位牛病毒性腹泻病毒的步骤如下:
[0032]一、材料:
[0033]牛病毒性腹泻病毒(Oregon株)；PK15传代细胞系。
[0034]本发明所采用的BVDV培养细胞为ΡΚ15细胞系，用TCID5q为10—5'Q/100yL的牛病毒性腹泻病毒Oregon株接种ΡΚ15细胞，放于37°C温箱孵育72h。
[0035]二、试剂:
[0036]QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay购自美国Affymetrix公司；八孔玻璃细胞培养板(Lab-Tek II Chamber Slide)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
[0037]三、步骤:
[0038]1、设计并合成牛病毒性腹泻病毒特异性探针和猪内参基因β-actin的特异性探针
[0039]对GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全序列利用Oligo 7.0软件设计4条特异性的BVDV探针，采用BLAST工具进行检索，验证以上序列的特异性。这4条针对牛病毒性腹泻病毒的特异性探针序列如下:
[0040]P1:5 ’-ATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGATCACAAAT-3’；
[0041 ] P2:5 ’-AGGTGGGTCCATAATAGGCTTGACTGCCCTCT-3’；
[0042]P3:5 ’-ATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGA-3’；和
[0043]P4:5 ’-GCTTCTTGGTACGGGGAGGAGGAAGTCTACGGTATGCCA-3’。
[0044]并对4条特异性探针均标记红色荧光基团。可选地，所述红色荧光基团选自Cy3基团、ROX基团、Texas Red基团和LC RED640基团中的至少一种。
[0045]对GenBank公布的猪看家基因Factin(ACTB)序列(AK237086)设计特异性探针作为内参，所述猪内参基因β-actin的特异性探针序列如下:
[0046]5’-ATGGAATCCTGTGGCATCACGAAACTACCTTCAACTCA-3’
[0047]并对该特异性探针标记绿色荧光基团。可选地，所述绿色荧光基团选自FAM基团或者FITC基团。
[0048]2、传代细胞的准备
[0049]将长满单层的PK-15细胞，用胰酶消化分散，利用血清浓度为10%的MEM细胞生长液终止消化，按照I: I传代比例获得传代细胞悬液，将细胞铺8孔玻璃细胞培养板，每孔120μ
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[0050]3、牛病毒性腹泻病毒种毒的