一种基于聚酰胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料技术领域，设及一种基于聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物 载体系统及其应用，具体是聚酷胺-胺功能化修饰环糊精阳离子聚合物的制备方法及其作 为载体系统的应用。
【背景技术】
[0002] 基因治疗是通过将外源性的基因导入体内的受体细胞，修复或替换有缺陷、受损 基因的方法;通过它可W广泛治疗严重的后天获得及先天遗传疾病如:癌症、获得性免疫缺 陷综合症、屯、血管疾病、传染病、及染色体相关的严重综合性免疫缺陷等;理论上，基因治疗 是一种简单有效的医治手段，只需要将病变基因替换成建康基因或是引入先天缺失的基因 W便产生所需的蛋白；事实上，为了使基因能够达到人体的祀向细胞并正确表达，其必须克 服众多阻碍才能实现。
[0003] 虽然病毒型载体具有低病原性、广泛取向性、转染效率高的特点，但其具有的高免 疫原性、基因插入突变风险、基因导入的瞬时表达W及较低的基因装载能力等因素极大地 限制了病毒型载体的应用;数据显示，由于具有严重的副作用产生，逆转录病毒载体用于重 症综合性免疫缺陷（SCID)的治疗使用已经由28%下降到19.7%;相反，基于非病毒载体系统 制备的新型传递系统的临床实验研究正在快速增长，聚酷胺-胺(PAMAM)生物材料是W乙二 胺为核，通过迈克尔加成反应制备的，分子外层的伯氨基质子化形成-N出+基团，可W充当 结合位点，而分子内叔胺基充当了 "质子海绵"，提供了良好的缓冲能力，从而提高转染效 率;虽然聚酷胺-胺表现出良好的基因传递能力，但随着分子量的增加，其毒性也在显著提 高；正是基于上述原因，对于PAMAM的分子修饰成为了目前研究的热点，旨在通过键合功能 性基团或带功能性基团的分子，W达到改善原有性能，拓宽使用范围的目的。
[0004] 经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)是治疗屯、肌梗塞等屯、脏疾病的微创介入疗法，但 该法在采用球囊治疗时不可避免的造成血管内皮产生机械性损伤，导致PTCA术后3-6月内 仍有近50%的患者发生血管再狭窄，临床上用于防治术后血管再狭窄通常介入安置一枚或 多枚血管支架，但顺应性差始终是难W解决的问题。
[0005] 丹参酬n A来自于唇形科植物丹参的根茎，其药理作用为改善冠状动脉循环，抑制 血栓疾病发生，丹参素具有显著扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，降低屯、肌耗氧量，同时，丹 参酬EA具有血管内皮细胞损伤修复的功能;基于上述原因，需要设计和研发一种针对于血 管内皮的损伤特点的新型输送载体系统，W解决上述问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提出一种基于聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统及其应 用，具体的是，制备一种环糊精内核，外部功能化修饰聚酷胺-胺的阳离子聚合物载体系统， 该阳离子聚合物主要用于基因药物载体及基因传递。
[0007]为实现上述目的，本发明公开了一种基于聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物载体 系统及其应用，所述载体系统由环糊精经聚酷胺-胺功能化修饰而成，所述载体系统的化学 结构如下：
其中，环糊精为e-环糊精或其衍生物，丫-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺粉。，末 端为胺基化的聚酷胺-胺化0-G4)，m=2-6。
[000引作为本发明进一步的方案:所述载体系统的平均分子量为2199-43858。
[0009] 作为本发明再进一步的方案:所述载体系统的制备方法，包括W下步骤： (1) 定量称取环糊精置于500ml圆底烧瓶中，加入无水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A， 定量称取N，N-幾基二咪挫，加无水DMSO溶液并形成澄明溶液B; (2) 在氮气保护条件下，将溶液AWSmlA的速度滴加至溶液B中，滴加完毕后避光条件 下室溫揽拌16-24h，将揽拌后得到的反应溶液加入到乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，室溫 下W3000rpm条件离屯、lOmin，弃上清溶液得白色粘稠沉淀物，将白色粘稠沉淀物采用乙酸 与四氨巧喃混合液洗涂2-3次后，减压干燥除去有机溶媒，用无水DMSO溶解形成溶液C; (3 )将整代PAMAM置于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入无水DMSO溶解形成溶液D，氮气保 护下，将溶液CW5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光条件下室溫揽拌16-24h;将揽拌后所得 反应溶液加入到乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，室溫下W3000巧m条件离屯、IOmin，弃去上 清溶液得淡黄色粘稠沉淀物； (4)将淡黄色粘稠沉淀物用双蒸水溶解，置于透析袋中并揽拌，每化换水，透析3天，所 得透析液在真空度小于等于13pa条件下进行冷冻干燥，得白色目标产物。
[0010] 作为本发明再进一步的方案:所述步骤1中环糊精与N，N-幾基二咪挫反应摩尔比 为1:50-1:100,环糊精与PAMAM的摩尔比为1:42-1:120。
[0011] 作为本发明再进一步的方案:所述步骤2和步骤3中乙酸与乙酸乙醋的混合溶液按 照乙酸与乙酸乙醋的体积比为1:1-1: 3配置，反应溶液与乙酸与乙酸乙醋的混合溶液的体 积比为 1:10-1:50。
[0012] 作为本发明再进一步的方案:所述白色目标产物与DNA形成的复合物体系平均粒 径为 50-250nm，PDI 为0.1-0.25，zeta 电位为 12-46mv。
[0013] 作为本发明再进一步的方案:所述环糊精经聚酷胺-胺功能化修饰后形成的载体 系统具有同时装载丹参酬HA药物的功能，能够共同负载药物与基因。
[0014] 作为本发明再进一步的方案:所述载体系统与丹参酬EA的摩尔比为0.8:1-1.2: Io
[0015] 作为本发明再进一步的方案:所述载体系统在体外基因细胞转染及动脉血管再狭 窄的治疗方面的应用。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明针对于血管内皮的损伤特点，审U 备了一种W环糊精经聚酷胺-胺功能化修饰而成的新型输送载体系统，该系统可W同时负 载丹参酬类药物及基因，可有效针对受损的内皮进行修复，抑制组织细胞增生，达到协同治 疗的效果，在PTCA术后再狭窄的防治方面有很好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明中聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物红外光谱图。
[0018] 图2本发明中聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物毒性试验结果示意图。
[0019] 图3本发明中聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物体外转染结果示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021] -种基于聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统，由环糊精经聚酷胺-胺功能 化修饰而成;所述载体系统的化学结构如下：
其中，环糊精为e-环糊精或其衍生物，丫-环糊精或其衍生物，PAMAM为乙二胺粉。，末 端为胺基化的聚酷胺-胺化〇-G4)，m=2-6;所述载体系统的平均分子量为2199-43858。
[0022] 所述基于聚酷胺-胺的环糊精功能化衍生物载体系统的制备方法，包括W下步骤： (1) 定量称取环糊精置于500ml圆底烧瓶中，加入无水DMSO溶解并形成澄清透明溶液A， 定量称取N，N-幾基二咪挫，加无水DMSO溶液并形成澄明溶液B; (2) 在氮气保护条件下，将溶液AWSmlA的速度滴加至溶液B中，滴加完毕后避光条件 下室溫揽拌16-24h，将揽拌后得到的反应溶液加入到乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，室溫 下W3000rpm条件离屯、lOmin，弃上清溶液得白色粘稠沉淀物，将白色粘稠沉淀物采用乙酸 与四氨巧喃混合液洗涂2-3次后，减压干燥除去有机溶媒，用无水DMSO溶解形成溶液C; (3 )将整代PAMAM置于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入无水DMSO溶解形成溶液D，氮气保 护下，将溶液CW5ml/h的速度滴加至溶液D中，避光条件下室溫揽拌16-24h;将揽拌后所得 反应溶液加入到乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，室溫下W3000巧m条件离屯、IOmin，弃去上 清溶液得淡黄色粘稠沉淀物； (4)将淡黄色粘稠沉淀物用双蒸水溶解，置于透析袋中并揽拌，每化换水，透析3天，所 得透析液在真空度小于等于13pa条件下进行冷冻干燥，得白色目标产物。
[0023] 所述步骤1中环糊精与N，N-幾基二咪挫反应摩尔比为1:50-1:100,环糊精与PAMAM 的摩尔比为1:42-1:120。
[0024] 所述步骤2和步骤3中乙酸与乙酸乙醋的混合溶液按照乙酸与乙酸乙醋的体积比 为1:1-1:3配置，反应溶液与乙酸与乙酸乙醋的混合溶液的体积比为1:10-1:50。
[00巧]所述白色目标产物与DNA形成的复合物体系平均粒径为50-250nm，PDI为0.1-0.25，ze1:a 电位为 12-46mv。
[0026] 所述环糊精经聚酷胺-胺功能化修饰后形成的载体系统具有同时装载丹参酬EA 药物的功能，能够共同负载药物与基因，所述载体系统与丹参酬HA的摩尔比为0.8:1-1.2: 1;所述载体系统在体外基因细胞转染及动脉血管再狭窄的治疗方面的应用。
[0027] 实施例1 称量0-CDO. 114g，加入25ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-幾基二咪挫 0.81 Ig置于500ml圆底烧瓶中，加入25ml无水DMSO溶解成溶液B，氮气保护并在快速磁力揽 拌条件下，将溶液AW lml/5min速度滴入到溶液B中，避光室溫揽拌16h;将所得产物溶液加 入到900ml乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，产生白色浑浊;将浑浊液在3000巧m条件下离屯、 lOmin，弃去上清溶液并用上述乙酸与乙酸乙醋混合液洗涂2-3次，备用;将获得的固体使用 25ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-Gl 1.02g溶解于150ml无水DMSO中得溶液D; 在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D中，避光揽拌16h;将所得产物溶液加入到1200ml 乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，于3000rpm条件下离屯、lOmin，将所得固体用双蒸水溶解，放 置于截留分子量3500的透析袋中透析3天，将透析液冷冻干燥，得白色目标产物，收率 24.7〇/〇。
[0028] 实施例2 称量0-CDO. 224g，加入25ml无水DMSO溶解形成澄清溶液A，另精密称量N，N-幾基二咪挫 2.044g置于500ml圆底烧瓶中，加入25ml无水DMSO溶解成溶液B;氮气保护并在快速磁力揽 拌条件下，将溶液AW lml/5min速度滴入到溶液B中，避光室溫揽拌16h;将所得产物溶液加 入到1500ml乙酸与乙酸乙醋的混合溶液中，产生白色浑浊;将浑浊液在3000rpm条件下离屯、 lOmin，弃去上清溶液并用上述乙酸与乙酸乙醋混合溶液洗涂2-3次，备用;将上一步骤获得 的固体使用25ml无水DMSO溶解的溶液C，再精密称取PAMAM-Gl 10.224g溶解于150ml无水 DMSO中得溶液D;在氮气保护下，将溶液C缓慢滴加至溶液D