，进行第二轮菌藻共培养，培养条件均为28°C，光强 2000LUX，光周期为12hr昼/1化r夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，其中：步骤 3)中菌藻共培养试验组A和纯藻培养对照组CA的第二轮培养周期设定为4天;菌藻共培养试 验组B和纯藻培养对照组CB的第二轮培养周期设定为8天。
[0033] 5)两轮菌藻共培养结束后，取培养液Iml采用血球计数板法测定培养液中的蛋白 核小球藻细胞数目，计算蛋白核小球藻的藻细胞浓度(个cell/mL)。
[0034] 结果见表1:
[0035] 6)将各组培养液8000r/min离屯、lOmin，收集菌藻细胞沉淀，按菌藻细胞沉淀体积 和无菌蒸馈水体积比（Ig: IOmU加入无菌蒸馈水震荡重悬充分洗涂后，再次8000r/min离屯、 lOmin，如此重复洗涂3次，最后收集干净的菌藻细胞沉淀，并于37-40°C低溫烘干得到菌藻 细胞干品，对菌藻细胞干品进行称重，计算菌藻细胞干重得率(mg/L)和菌藻细胞干重产率 (mg/L ? d)。
[0036] 结果见表1:
[0037] 表1菌藻共培养对蛋白核小球藻藻细胞生长速率和干重产率的影响 [00；3 引
[0039] 注:表中数据为=组数据平均值。
[0040] 菌藻细胞干重产率(mg/L ? d)=纯藻（菌藻）细胞干重得率(mg/L)/培养总天数 (d);
[0041] 由此实施例可知，采用本发明的提高叶黄素产量的人工菌藻共培养技术，按水稻 内生泛菌与蛋白核小球藻的菌藻接种比为1000:1时，经过两轮加菌共培养，培养周期分别 为12和16天时，所收获的菌藻共培养液中藻细胞浓度分别同比对照增加93.97倍和103.93 倍，菌藻细胞干重产率分别同比纯藻培养对照组增加65.55和72.36倍，虽然菌藻细胞干重 指标中包含部分水稻内生泛菌的质量，但本实施例中藻细胞浓度指标证实了菌藻共培养组 藻细胞确实大幅增加，可见水稻内生泛菌共培养对促进蛋白核小球藻的生长和提高细胞收 获量效果极为显著。其中第二轮培养周期越长，技术效果越明显。
[0042] 实施例二：
[0043] 为了验证本发明的人工菌藻共培养技术对提高小球藻叶黄素产量的技术效果，按 如下步骤操作：
[0044] I)将上述实施例一纯藻培养对照组(CA和CB)和相应菌藻共培养试验组(A和B)收 获的藻细胞和菌藻细胞干品，各准确称取藻粉0.1 g,按料液比(g:ml) = 1:40加入提取液（甲 醇：二氯甲烧体积比= 2:l)4ml，室溫25°C条件下，置于槽式超声波发生器水槽中于320W功 率水浴处理破碎细胞10分钟，间歇5分钟，再破碎细胞10分钟，然后静置于40°C恒溫水槽中 提取10分钟，然后6000r/min离屯、IOmin，分别收集上清叶黄素提取液和细胞碎渣沉淀。对细 胞碎渣沉淀加入提取液重复提取两次，合并=次提取上清即得总叶黄素提取液，量取提取 液总体积。
[0045] 2)采用高效液相色谱法测定提取液中叶黄素的含量，具体实验操作方法参照文献 (桂林，等.高效液相色谱法测定蛋白核小球藻中的叶黄素.食品与发酵工业，2005,31(11): 95-97)，根据标准曲线回归方程计算藻细胞和菌藻细胞叶黄素得率(mg/L)、含量(mg/g)和 产率(mg/L- d)，结果见表2:
[0046] 表 2
[0047]
[0048] 注:表中数据为=组数据平均值。
[0049] 采用本发明的提高叶黄素产量的人工菌藻共培养技术，按水稻内生泛菌与蛋白核 小球藻的菌藻接种比为1000:1时，经过两轮加菌共培养，培养周期分别为12和16天时，所收 获的菌藻细胞叶黄素含量同比对照有所增加，增加幅度分别为14.26%和12.31 %，与对照 差异不显著;但菌藻细胞叶黄素产率分别同比纯藻培养对照组增加68.67和75.00倍，提高 幅度极为显著，运主要是由于藻细胞收获生物量增加的结果，其中第二轮培养周期越长，藻 叶黄素产率越高，技术效果越明显。
【主权项】
1. 一种通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束 后，得到第一轮菌藻共培养液； 2) 在第一轮菌藻共培养液中再补加第二次加入的水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮 菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液； 3) 对第二轮菌藻共培养液经离心后得到菌藻细胞沉淀，之后经后处理得到菌藻细胞干 品； 4) 将小球藻细胞干品粉碎，得到菌藻粉，之后采用有机溶剂提取液提取叶黄素，得到叶 黄素。2. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的小球藻为蛋白核小球藻。3. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的第一轮菌藻共培养的条件为:培养条件均为23°C~33°C，光强1500~2500LUX，光 周期为10~14hr昼/10~14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混勾2~6次直至培养周 期结束，培养周期为6~12天。4. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤1) 中，所述的第一次加入的水稻内生泛菌和小球藻的菌藻比为1~10000:1。5. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的第二轮菌藻共培养的条件为:培养条件均为23°C~33°C，光强1500~2500LUX，光 周期为10~14hr昼/10~14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混勾2~6次直至培养周 期结束，培养周期为2~12天。6. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤2) 中，所述的第二次加入的水稻内生泛菌和第一次加入的水稻内生泛菌的比为〇. 25~4:1。7. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤3) 中，所述的离心为:6000~10000r/min离心5~20min。8. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤3) 中，所述的后处理包括:将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经6000~10000r/min离 心5~20min后收集，之后在30°C~50°C低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。9. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤4) 中，所述的有机溶剂提取液为甲醇-二氯甲烷提取液，所述的甲醇-二氯甲烷提取液由体积 比1~3:1的甲醇和二氯甲烷组成。10. 根据权利要求1所述的通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，其特征在于，步骤 4)中，所述的菌藻粉的质量与有机溶剂提取液的体积为lg:25~60ml。
【专利摘要】本发明公开了一种通过菌藻共培养提高叶黄素产量的方法，包括：1)将水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行第一轮菌藻共培养，培养结束后，得到第一轮菌藻共培养液；2)在第一轮菌藻共培养液中再补加水稻内生泛菌，在光照下进行第二轮菌藻共培养，培养结束后，得到第二轮菌藻共培养液；3)对第二轮菌藻共培养液经离心后得到菌藻细胞沉淀，之后经后处理得到菌藻细胞干品；4)将小球藻细胞干品粉碎，得到菌藻粉，之后采用有机溶剂提取液提取叶黄素，得到叶黄素。本发明通过应用水稻内生泛菌和小球藻进行菌藻共培养提高小球藻细胞的生长速率和生物量，同时提高藻细胞的叶黄素含量，在小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。
【IPC分类】C12R1/89, C12P23/00, C12P39/00, C12R1/01
【公开号】CN105695554
【申请号】CN201610154081
【发明人】赵艳
【申请人】浙江工商大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月17日