一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用

一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用。所述高硫酸化硫酸软骨素，分子量为100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖组成为：O?unit，C?unit，A?unit，E?unit。该高硫酸化硫酸软骨素是由美洲大赤鱿的软骨中提取出的富含E?unit的硫酸软骨素，其具有特异二糖组成、糖链排列、分子量的DG?CS。通过实验证明该高硫酸化硫酸软骨素具有很好的抗肿瘤转移活性。
【专利说明】
-种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用，特别设及一种巨型銳 鱼软骨来源天然新型高硫酸化硫酸软骨素的制备及其在抗肿瘤方面的应用，属于生物技术
技术领域。
【背景技术】
[0002] 硫酸软骨素(简称CS)是一种酸性黏多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、整鱼骨、銳 鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子。其基本组成单位是D-葡萄糖 醒酸和N-乙酷-D-氨基半乳糖通过0-1，3糖巧键连结而成的二糖（一461加曰01一36曰1魁姐1 自然界中大多数的CS是WN-乙酷-D-氨基半乳糖的4位或6位发生硫酸化的形式存在 的，我们分别称之为CS-A、CS-C。除了CS-A、CS-C外，根据D-葡萄糖醒酸和N-乙酷-D-氨基半 乳糖硫酸化模式不同还存在包括〔5-0^5-6、〔5-0、〔5-1(等在内的多种异构体[2]^5-4^5- C、CS-O、CS-E的结构式化下所示：
[0003]
[0004] 值得一提的是CS-E是硫酸软骨素中的重要一员，其富含N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4 位和C-6位发生硫酸化的高硫酸化二糖单位巧-unit)，使其带有大量负电荷，形成特定的分 子结构。运种特性更利于其与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞粘附分子、脂蛋白特异性 结合，进而调节神经生长、生长因子信号转导、创伤愈合、感染、肿瘤细胞迁移W及肿瘤细胞 增值等生理或病理过程W。从而在抗肿瘤细胞转移、促进神经突触生长、刺激软骨细胞合成 II型胶原中发挥关键作用，对癌症、关节炎、神经痛等疾病有很好的预防、辅助治疗作用W。
[0005] 癌症是导致全球死亡率的一个重要原因。癌症之所W是人类久攻不下的难题，与 其自身的病症特性有很大的关系，其中最为棘手的是癌细胞可不断迁移并侵入正常组织形 成新的转移灶。研究发现在运一过程中肿瘤细胞硫酸软骨素的含量、组成、分子大小及分子 结构与相应的正常组织有明显差异。而运种差异是肿瘤细胞迁移、侵入正常组织的先决条 件。所W根据肿瘤细胞的运一特性，硫酸软骨素的抗肿瘤研究已经成为国内外研究的热点。 深入研究发现硫酸软骨素抗肿瘤活性对硫酸软骨素硫酸化模式、分子量等都有严格要求， 其中E-un i t的含量最为关键。商品化的CS-E的E-un i t含量在60 %左右，硫酸化度约1.5，分 子量范围为50~140kDa，但是其价格昂贵，且生产工艺主要集中于日本。国内关于提取富含 E-unit的硫酸软骨素的研究文献寥寥无几，仅有的报道中制备出的CS硫酸化度仅有0.5左 右最重要的是制备运种CS-E的原料来自一种名为太平洋權皱鱼（Todarodes F*acificus)的小型銳鱼，但是Todarodes Pacificus软骨含量很少无法形成大量生产，并且 近年来随着海洋污染加剧Todarodes Pacifi州S渔获量逐年递减，价格上升。
[0006] 中国专利文献CN1563098A(申请号200410006223.5)公开了一种制备硫酸软骨素 的方法，该方法包括W下步骤:A.将卡拉胶分解为分子量为1-4万，优选2-3万的卡拉胶寡 糖;B.将銳鱼骨用15%到饱和的强碱液处理，然后用酸中和，收集胶体;C.将步骤A制得的卡 拉胶寡糖、步骤B制得的胶体和氨基葡萄糖在酸性条件下反应，再纯化，获得硫酸软骨素。该 方法采用强碱处理，从而导致获得的硫酸软骨素的硫酸化程度较低，而且引入的卡拉胶，不 利于硫酸软骨素的纯化，导致硫酸软骨素纯度低，相关应用价值大幅下降。
[0007] 因此寻找富含E-unit硫酸软骨素的新原料，不仅可W缓解太平洋權皱鱼的生存压 力更能拓宽富含E-unit硫酸软骨素原料来源。研究发现不同种属动物体内所存在的硫酸软 骨素亚型的含量、种类各不相同，同一动物因年龄、组织部位的不同硫酸软骨素的种类、含 量也在不断变化。运一发现为制备不同种类的硫酸软骨素提供了很好的理论基础。一般来 说，在牛的喉骨、鸡软骨、嫁鱼软骨中CS-A含量最高，可达76.2-90%;整鱼翅软骨中CS-D的 含量最为丰富，而在其它整鱼软骨中CS-C含量最高，可达72.9%;銳鱼软骨来源CS中E-unit 含量最高，可达60 %。
[000引美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)生长周期短、产量大、价格便宜，而软骨骨质硬无 法食用，一般作为废料丢弃。对美洲大赤銳的软骨进行研究利用，目前还未有相关报道。

【发明内容】

[0009]本发明针对现有技术的不足，提供一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应 用。该高硫酸化硫酸软骨素是由美洲大赤銳的软骨中提取出的富含E-unit的硫酸软骨素， 其具有特异二糖组成、糖链排列、分子量的DG-CS。通过实验证明该高硫酸化硫酸软骨素具 有很好的抗肿瘤转移活性。
[0010] 术语说明
[0011] 0-unit是指:不发生硫酸化的硫酸软骨素(CS)二糖单位。
[0012] c-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-6位发生硫酸化的硫酸软骨素（CS)二糖单 位。
[0013] A-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4位发生硫酸化的硫酸软骨素（CS)二糖单 位。
[0014] E-unit是指:N-乙酷-D-氨基半乳糖C-4位和C-6位发生硫酸化的硫酸软骨素（CS) 二糖单位。
[0015] 本发明的技术方案如下：
[0016] 一种高硫酸化硫酸软骨素，分子量为100~800邸a，硫酸化度在0.7~1.43，二糖组 成如下，均为质量百分比： 0-unit 3.9'、-10%; C-unit 11.8--35%;
[0017] A-unil 30 -37.7%; E-unil i9--46.6%。
[0018] 根据本发明优选的，所述高硫酸化硫酸软骨素分子量为623.2KDa，硫酸化度在 1.43，二糖组成如下，均为质量百分比： 0-unit 3.9%; C-Linit 11.8%；
[0019] A-unh 37.7%； E-unit 46.()%。
[0020] 上述高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：
[0021] (1)将美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入有机溶剂进行脱水脱脂，干 燥，制得脱脂软骨；
[0022] (2)向步骤（1)制得的脱脂软骨中加水浸没处理，固液分离，向沉淀中加入酶反应 缓冲液，混合均匀，调pH 5.0~9.0，加入蛋白酶在40~70°C酶解反应24~96h，灭活酶，固液 分离，取液体，制得酶解粗液；
[0023] 所述蛋白酶黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶与其他蛋白酶的混合;蛋白酶的加入 量为脱脂软骨干重的1%〇~5%〇,黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的质量百分含量为20~100%;
[0024] (3)将步骤(2)制得的酶解粗液经除蛋白后，调抑至7.0~10.0,然后加入酶解粗液 质量百分比1~10%的化AC固体，溶解，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到50 %~ 85%，固液分离，取沉淀，制得初级多糖；
[0025] (4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，经阴离子交换树脂纯化，WO~2.5M氯 化钢溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱峰，醇沉，固液分离，超滤，干燥，制得高硫酸化硫酸软骨 素。
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，有机溶剂为丙酬或无水乙醇，有机溶剂的加 入量为沉淀体积的2~4倍;脱水脱脂的时间为4~24h，次数为2~4次。
[0027] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，处理条件为:在60~100°C处理10~30min。
[0028] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，酶反应缓冲液为氯化巧棚酸缓冲液，氯化巧 浓度为5~IOmM,棚酸浓度为50~IOOmM, pH7.0~9.0。
[0029] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，其他蛋白酶为链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶和/ 或膜蛋白酶混合酶;链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶、膜蛋白酶为普通市售产品，如可购自Sigma 公司。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，黑曲霉蛋白酶为普通市售产品，如可购自TCI 公司。
[0031] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，酶解反应过程中，还包括两次蛋白酶补加步 骤，每次不加量均为上次加酶量的0.4~0.6倍，第一次补加时间为酶解反应6~2地，第二次 补加时间为酶解反应12~48h。
[0032] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，灭活酶条件为沸水浴中静置5~20min。
[0033] 根据本发明优选的，所述固液分离均为离屯、，条件为5000~lOOOOrpm/min离屯、5~ 20min〇
[0034] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，除蛋白的具体步骤如下：
[0035] 按步骤(2)制得的酶解粗液体积的2~10%加入S氯乙酸(TCA)，离屯、，取上清液， 加入乙酸抽提=氯乙酸，去除乙酸。
[0036] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，阴离子交换树脂纯化的具体条件为初级多糖 溶解于水中，浓度为lOmg/ml，加入硫酸软骨素重量40~80%的阴离子交换树脂室溫解育 0.5~化，Wo~2.5M氯化钢溶液浓度梯度洗脱分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰。
[0037] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，醇沉的乙醇体积浓度为50%~85%;超滤膜 的截留分子量为IOkDaW上;干燥溫度为不超过80°C。
[0038] 上述高硫酸化硫酸软骨素在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0039] 有益效果
[0040] 1、本发明首次公开了美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)可W作为富含E-unit硫酸软 骨素的原料来源制备高硫酸化硫酸软骨素。由于美洲大赤銳生长周期短、产量大、价格便 宜，而软骨骨质硬无法食用，一般作为废料丢弃，因此不仅可W极大的扩大硫酸软骨素的原 料来源，而且可W变废为宝，减少环境污染；
[0041] 2、本发明从美洲大赤銳软骨中提取的高硫酸化硫酸软骨素，在二糖组成、分子量 等方面与已知的CS-E显著不同。抗肿瘤实验表明，本发明所制备获得的美洲大赤銳硫酸软 骨素(简称DG-CS)，在体内其具有很强的抗肿瘤转移活性，在体外可W与多种生长因子相互 作用，为研发新型抗肿瘤糖类药物提供了原料和理论基础；
[0042] 3、本发明所述的高硫酸化硫酸软骨素的制备方法较传统制备方法，不需要碱处理 步骤，反应条件溫和、酶用量少、易形成工业化生产，制得的高硫酸化硫酸软骨素成本低，市 场价值高，而且抗凝血活性低不会引发体内溶血等副作用，可用于医药研发、疾病治疗、科 学研究等领域；
[0043] 4、本发明所述制备方法制得的高硫酸化硫酸软骨素收率可W达18~20%，纯度可 W达到95% W上。
【附图说明】
[0044] 图1为质量浓度为1%的DG-CS经Nano化OP K5600分析200-800nm全波长扫描图。
[0045] 图2为DG-CS经化ondroteinase B(Sigma)Xhondroteinase ABC(Sigma)、 r肥La S e、Hy a 1 ur on i da S e生物酶降解后经HPLC分析图谱。
[0046] 图3为本发明制备的DG-CS分子量检测图谱。
[0047] 图4为本发明制备的DG-CS经CSase AB邱華解后二糖组成图谱。
[004引图5为本发明制备的DG-CS素抗凝血、抗血栓活性的检测图谱。
[0049] 图中：A为本发明制备的DG-CS与精品肝素化P)的抗FII活性，B为本发明制备的DG- CS与精品肝素化P)的抗FXa活性。
[0050] 图6为本发明制备的硫酸软骨素抗肿瘤转移活性统计分析柱状图。
[0051] 图7为本发明制备的硫酸软骨素与肿瘤相关生物大分子生长因子相互作用图谱。
[0052] 图中：A:碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，B:肝细胞生长因子化GF)，C:选择素-L (SE化），D:选择素-E (沈LE)，E:选择素-P (沈LP)。
【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例进一步全面公开本发明如何实施的技术方案，运些实施例不能理 解为是为了限制发明的应用范围。发明人已尽力保证实验中各种数据的准确性，但实验上 的一些偏差在所难免。常规方法不再特殊说明。
[0化4] 生物原料来源
[0055]美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)软骨购置于山东济南维尔康水产品批发市场； [0化6] 实施例1
[0057] -种高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：
[005引（1)将化g美洲大赤銳(Dosidi州S Gigas)软骨粉碎后加入3倍体积无水乙醇脱水、 脱脂2地，过滤，重复脱水、脱脂步骤3次，然后50°C烘干称重，制得脱脂软骨；
[0059] (2)向步骤（1)制得的脱脂软骨中加水浸没，100°C水浴处理30min，冷却到室溫过 滤，向沉淀中加入20倍体积氯化巧棚酸缓冲液(0.1 M棚酸，IOmM氯化巧袖8.0)混匀，加入原 料干重2%〇的黑曲霉蛋白酶(购自TCI公司），于60°C反应72h，每隔24h补加1次酶，加酶量依 次递减为上次加酶量的0.5倍，共加2次，100 °C灭酶活IOmin，800化pm/min离屯、IOmin，取液 体，制得酶解粗液；
[0060] (3)向步骤(2)制得的酶解粗液中按质量百分比为5%的比例加入TCA(S氯乙酸）， 800化pm/min离屯、IOmin去沉淀得上清，所得到的上清中加入等体积乙酸抽提残余TCA，揽拌 吹气除去乙酸，加入化OH调节pH至8.0;然后加入酶解粗液质量5%的化AC固体，混匀，加入 乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到80%，800化pm/min离屯、IOmin取沉淀，制得初级多糖；
[0061] (4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，浓度为lOmg/ml，加入硫酸软骨素溶液 重量60%的A98阴离子交换树脂(购自德国朗盛公司）室溫解育O.化，Wo. 5M，IM，2M氯化钢 溶液分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰，2M氯化钢洗脱液合并醇沉，用孔径为IOkDa超滤膜超 滤脱盐，35 °C干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
[0062] 实施例2、DG-CS的纯度分析
[0063] 2.1蛋白和糖胺聚糖含量分析
[0064] 利用巧挫反应、BCA蛋白测定试剂盒、全波长扫描等技术手段检测制备得到的DG- CS纯度，发现样品中蛋白含量低于2%，在280nm附近蛋白吸收峰极小，如图1所示；由巧挫反 应测得糖胺聚糖含量在97 % W上，回收率为20 %。
[0065] 2.2其它糖胺聚糖含量分析
[0066] 众所周知，利用生物酶底物专一性等性质可W确定多糖样品种类。硫酸软骨素裂 解酶Oiomlroteinase ABC主要降解硫酸软骨素，硫酸皮肤素裂解酶Chomlroteinase B可专 一性降解硫酸皮肤素(DS)，由中国专利文献CN103923899A(专利号201410160095.3)公开的 糖胺聚糖裂解酶巧化ase可降解硫酸软骨素（CS)和透明质酸化A) ,Hyaluronidase来源于 Streptomyces曲日1山"〇1八;[(3113专一降解HA。为了进一步确定所制备的美洲大赤銳硫酸软 骨素的纯度，我们利用化on化Oteinase B(购自Sigma公司）、化on化Oteinase ABC(购自 Sigma公司），Hyaluronidase(购自Sigma公司Kr肥Lase等酶在各自最适反应条件下处理样 品，然后进行册LC分析。HPLC分析条件为凝胶柱：Superdex? peptide 10/300G1^;流动相： 0.2M NH祖C03;流速:0.4血/min;检测条件：岛津紫外检测器(SPD-20A)检测结果如图2所示。
[0067] 分析发现所制备样品不能被畑ondroteinase B、Hyalu;ronidase降解，但可被 化on化Oteinase ABCjH化ase降解而产物无显著差异，证明样品为CS且不含DS、HA等糖胺 聚糖。
[0068] 实施例3DG-CS的分子量分析
[0069] 平均分子量分别为11.6KD、48.服D、147邸、273邸、409.8KD的葡聚糖标准和实施例 1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS(质量浓度1 % )，分别取10化1进行HPLC分析。
[0070] 册 LC 分析条件为凝胶柱：Ultrahydrogel? 100 7.8 X SOOmm(Water);流动相： 0.02MNa2HP04,0.02M化H2P04,0.02%NaN3，pH7.0;流速:0.6mL/min;检测条件：岛津示差 检测器(RID-IOA)。
[0071] 结果如图3所示，根据图3可W计算出制备DG-CS平均分子量在623.2KD左右。
[0072] 实施例4DG-CS的二糖组成分析
[0073] (1)多糖降解
[0074] 将质量浓度为1 %的实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS样品，与CSase ABC、5倍缓冲液（250mM Tris-肥l，250mM NaAC，PH 8.0)^及水按1:2:7(体积比）的比例混 合后，共，在最适溫度和最适pH下反应化条件下反应，离屯、浓缩仪上干燥。
[0075] (2)HPLC 分析
[0076] 二甲亚讽，冰醋酸，氯基棚氨化钢和2-氨基苯甲酯胺按质量比14:6:1:1混合，取扣 1加入到W上的降解体系中，65°C反应化，反应物用=氯甲烧抽提6次，干燥处理，用水溶解， 取SOiil进行HPLC分析。
[0077] 检测器：岛津巧光检测器RF-20A，柱子：YMC-Pack polyamin II column(250 X 4.6mm ID),流动相：1M Na出P〇4，16mM Na出P〇4,流速：lml/min。
[0078] 洗脱梯度如表1所示：
[0079] 表 1
[0080]
[0081] 结果如图4所示，由图4可W看出，经本发明制备的DG-CS主要由基本组成单位〇- unit(GlcA-GalNAc)、C-unit(GlcA-GalNAc(6S))、A-unit(GlcA-GalNAc(4S))、E-unit (GlcA-GalNAc(4S，6S))组成。
[0082] W图4的结果，利用HPLC积分计算出DG-CS中各种基本组成单元所占的含量所示。 W此为根据，进而计算出DG-CS硫酸化度在1.43W上，具有高硫酸化度的特点。实施例1制得 的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与商品化CS-E二糖组成、硫酸化度、分子量比较如表2所示。
[0083] 表 2
[0084]
[0085] 由上述结果可W看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与商品化CS-E二 糖组成、硫酸化度、分子量存在显著差异，是一种新型富含E-unit的高硫酸化CS。
[00化]实施例5、DG-CS抗凝血活性检测
[0087] 根据药典，检测实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与标准肝素化抗FXa、抗 FIIa活性，结果如表3所示。
[0088] 表 3
[0089]
[0090] 由表3可W看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS具有很低的抗FXa、抗 FIIa活性，分别为0.9U/mg、20U/mg，远远低于精品肝素（东营天东制药有限公司货号 KH1411048A)221U/mg、22抓/mg可有效避免体内溶血等副作用。
[0091] 实施例6、DG-CS抗肿瘤活性的检测
[0092] (1)培养肿瘤细胞:乳腺癌细胞株4T1在含10 %胎牛血清，lOOU/ml青霉素、IOOiig/ ml链霉素双抗，2mM非必需氨基酸、2mM k谷氨酷胺的DMBl培养液于37°C，5%C〇2培养箱传 代培养；
[0093] (2)收集细胞:待培养足够量的细胞后，用PBS清洗4T1肿瘤细胞，加入0.25 %膜蛋 白酶-6014在37°(：消化5-10111111，加入细胞培养液101111，悬浮洗涂细胞，1000巧111/111111离屯、 5min弃上清液，重复2次，离屯、收集细胞用适量PBS重悬；
[0094] (3)取IOiil单细胞悬浮液，用PBS 10倍稀释，用细胞计数板在倒置显微镜下计数；
[0095] (4)用PBS重悬4T1肿瘤细胞到终浓度2 X IO6个/ml待用；
[0096] (5)对小鼠分别尾部侧静脉注射PBS、50yg实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG- CSaOOiig实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CSJO化g实施例1制得的高硫酸化硫酸软 骨素06-〔5、10化旨精品肝素，10-60111111后经尾静脉注射肿瘤细胞20化1/小鼠，4周后解剖小 鼠统计小鼠体内实体瘤个数，检验抗肿瘤效果，结果如图6所示。
[0097] 与已有的抗肿瘤药物精品肝素相比DG-CS具有相当的抗肿瘤效果，最佳用药剂量 为10化g/只。计算抗肿瘤迁移活性：
[0098] (对照组平均每肺肿瘤个数一10化g实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS实 验组平均每肺肿瘤个数)/对照组平均每肺肿瘤个数X 100%
[0099] 经计算，高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性为77 %。
[0100] 实施例8、新型CS与生长素、生长因子相互作用
[0101] 利用Biacore-T200系统将生物素化的DG-CS固定在亲和素修饰的CM5忍片上，选择 素(P-选择素a-选择素、E-选择素）（来自于北京义翅神州生物技术有限公司）、生长因子 (碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、生长因子化GF)、等）（来自于北京义翅神州生物技术有 限公司）经皿S-EP，pH 7.4缓冲液与高硫酸化硫酸软骨素DG-CS相互作用，结果如图7所示， 通过Biacore-T200分析软件得出各蛋白分子与高硫酸化硫酸软骨素DG-CS作用的一些参数 如表4所示。
[0102] 表4DG-CS与蛋白分子相互作用
[0103]
[0104] 由表4可W看出，实施例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS与HGF、bFGF有很好的 结合作用，说明可能在CS抑制肿瘤转移过程中是通过与HGF、bFGF等相互作用进而调节细胞 信号转导来实现的。
[0105] 实施例9黑曲霉蛋白酶，木瓜蛋白酶质量比1:1混合酶制备高硫酸化硫酸软骨素
[0106] (1)将Ikg美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入加入3倍体积丙酬或无 水乙醇脱水、脱脂2地，3次后50°C烘干称重，制得脱脂软骨；
[0107] (2)向步骤（1)制得的脱脂软骨中加水浸没，100°C水浴处理30min，冷却到室溫过 滤，过滤分离，向沉淀中加入20倍体积氯化巧棚酸缓冲液(0.1 M棚酸，IOmM氯化巧pH8.0)混 匀，加入原料干重2%。的混合酶(黑曲霉蛋白酶与木瓜蛋白酶按质量比1:1混合，均为普通市 售产品），于60°C反应72h，每隔2地补加1次酶，加酶量依次递减为上次加酶量的0.5倍，共加 2次，100 °C灭酶活IOmin，8000巧m/min离屯、IOmin，取上清，制得酶解粗液；
[0108] (3)向步骤（2)制得的酶解粗液中按质量百分比为5%的比例加入TCA(S氯乙 酸），，离屯、去沉淀得上清，所得到的上清中加入等体积乙酸抽提残余TCA，加入化OH调节pH 至8.0;然后加入酶解粗液质量5 %的NaAC固体，混匀，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度 达到80% ,8000巧m/min离屯、IOmin，取沉淀，制得初级多糖；
[0109] (4)将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，浓度为lOmg/ml，加入硫酸软骨素溶液 重量60%的A98阴离子交换树脂室溫解育O.化，WO. 5M，IM，2M氯化钢溶液分别洗脱3倍柱体 积，收集洗脱峰，2M氯化钢洗脱液合并醇沉，800化pm/min离屯、IOmin收集沉淀，蒸馈水溶解 后用孔径为IOkDa超滤膜超滤，35°C干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。
[0110] 对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行纯度、回收率检测，方法同实施 例2,实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS纯度、回收率分别为95%、17%。
[0111] 对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行分子量检测，方法同实施例3，实 施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS分子量为467.2kDa。
[0112] 对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行二糖组成分析，方法同实施例4， 实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素二糖组成为：
[0113]
[0114]
[0115] 对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗凝血检测方法同实施例5,实 施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素抗FXa、抗FIIa活性，分别为0.3U/mg、12U/mg;
[0116] 对实施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗肿瘤实验方法同实施例6,实 施例9制得的高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性为65%。
[0117] 对比例1用传统制备方法利用美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)软骨制备硫酸软骨 素
[0118] 按照传统制备方法用美洲大赤銳(Dosidicus Gigas)软骨制备硫酸软骨素，具体 方法参见(方旭波，陈小娥，余辉，宋茹(2009).銳鱼硫酸软骨素糖蛋白的分离纯化和鉴定. 中国食品学报.09(4): 103-108.)。
[0119] 对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行纯度、回收率检测，方法同实施 例2，对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS纯度、回收率分别为90%、18%。
[0120] 对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行分子量检测，方法同实施例3,对 比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS分子量为90.8kDa。
[0121] 对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行二糖组成分析，方法同实施例4， 对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素二糖组成为：
[0122]
[0123] ________
[0124] 对对比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素DG-CS进行抗肿瘤实验，方法同实施例6,对 比例1制得的高硫酸化硫酸软骨素抗肿瘤迁移活性不显著。
[0125] 说明书中设及的参考文献
[0126] 1.Fuchuan Li,Gerdy B.ten Dam,Sengottuvelan Murugan.(2008)Involvement of Highly Sulfated Chondroitin Sulfate in the Metastasis of the Lewis Lung Carcinoma CelIs.J. Biol. Qiem.283:34294-34304.
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【主权项】
1. 一种高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，分子量为100~SOOKDa，硫酸化度在0.7~ 1.43，二糖组成如下，均为质量百分比： O-unit 3.9^" 10%： C--unii 11.8 ~35%; A-unii 30 ~37,7%; E-unit 19 ~46.6%。2. 如权利要求1所述的高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，所述高硫酸化硫酸软骨素分 子量为623.2KDa，硫酸化度在1.43,二糖组成如下，均为质量百分比： O-unit 3.9%； C-unil 丨丨.8%; A-unii 37.7%； E-unit 46.6% 〇3. 权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)软骨粉碎后加入有机溶剂进行脱水脱脂，干燥， 制得脱脂软骨； (2) 向步骤（1)制得的脱脂软骨中加水浸没处理，固液分离，向沉淀中加入酶反应缓冲 液，混合均匀，调pH 5.0~9.0，加入蛋白酶在40~70°C酶解反应24~96h，灭活酶，固液分 离，取液体，制得酶解粗液； 所述蛋白酶黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶与其他蛋白酶的混合;蛋白酶的加入量为 脱脂软骨干重的1%。~5%。，黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的质量百分含量为20~100% ; (3) 将步骤(2)制得的酶解粗液经除蛋白后，调pH至7.0~10.0,然后加入酶解粗液质量 百分比1~10%的NaAC固体，溶解，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到50%~85%， 固液分离，取沉淀，制得初级多糖； (4) 将步骤(3)制得的初级多糖溶解于水中，经阴离子交换树脂纯化，以0~2.5M氯化钠 溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱峰，醇沉，固液分离，超滤，干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，有机溶剂为丙酮或无水 乙醇，有机溶剂的加入量为沉淀体积的2~4倍;脱水脱脂的时间为4~24h，次数为2~4次。5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，处理条件为:在60~100 °C 处理 10~30min; 优选的，所述步骤(2)中，酶反应缓冲液为氯化钙硼酸缓冲液，氯化钙浓度为5~10mM， 硼酸浓度为50~100mM，pH7.0~9.0。6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，其他蛋白酶为链霉蛋白 酶E、木瓜蛋白酶和/或胰蛋白酶混合酶； 优选的，所述步骤(2)中，酶解反应过程中，还包括两次蛋白酶补加步骤，每次不加量均 为上次加酶量的0.4~0.6倍，第一次补加时间为酶解反应6~24h，第二次补加时间为酶解 反应12~48h。7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，灭酶活条件为沸水浴中 静置5~20min; 优选的，所述固液分离均为离心，条件为5000~lOOOOrpm/min离心5~20min。8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)中，除蛋白的具体步骤如 下： 按步骤(2)制得的酶解粗液体积的2~10%加入三氯乙酸(TCA)，离心，取上清液，加入 乙醚抽提三氯乙酸，去除乙醚。9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，阴离子交换树脂纯化的 具体条件为初级多糖溶解于水中，浓度为l〇mg/ml，加入硫酸软骨素重量40~80%的阴离子 交换树脂室温孵育0.5~2h，以0~2.5M氯化钠溶液浓度梯度洗脱分别洗脱3倍柱体积，收集 洗脱峰； 优选的，所述步骤(4)中，醇沉的乙醇体积浓度为50%~85%;超滤膜的截留分子量为 lOkDa以上;干燥温度为不超过80°C。10. 权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K31/737GK105924544SQ201610323540
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】李福川, 王庆彬, 彭春娥, 陈翔雪, 韩乃寒
【申请人】山东大学