产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
【专利摘要】本发明涉及产3?羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒状杆菌中过表达内源的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因hdpA，并过表达甘油脱氢酶基因gldA、甘油脱水酶及其激活因子基因pduCDEGH及3?羟基丙醛脱氢酶基因aldH构建得到的。利用该重组菌发酵生产3?羟基丙酸，由于谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，因此可进一步降低原料的成本。本发明解决了生物安全性以及菌株对酸的耐受性问题。同时发酵过程中的菌体可作为产品，用于饲料添加剂中。本方法副产物少，使终产物3?羟基丙酸的分离过程得到简化。
【专利说明】
产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种产3-羟基丙酸的重 组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 3-羟基丙酸是一种重要的潜在平台化合物。2004年，美国能源部列出了当前世界 12种最具潜力开发的生物基化工产品，3-羟基丙酸位列第三。3-羟基丙酸是一种重要的功 能性有机酸，可以直接作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。其更重要的潜在用途是作为一 种C3平台化合物，通过耦合现有的成熟催化技术如脱水、氧化、还原、酯化、聚合等反应将其 转化为多种重要的化工产品，如丙烯酸、丙二酸、1，3_丙二醇、丙烯酰胺、丙烯氰、聚3-羟基 丙酸等。3-羟基丙酸作为平台化合物具有非常广阔的市场前景。
[0003] 目前，3-羟基丙酸的工业化生产几乎全部基于化学合成法，主要包括丙烯酸水合 法和3-羟基丙氰水解法等。由于这些方法都是基于昂贵的石油化工原料，且产品分离过程 复杂、污染严重等，利用化学法生产3-羟基丙酸的经济效益差，实际工业产量很低，未能使 其成为一种广泛应用的平台化合物。因此，开发可利用廉价丰富的原料直接生产3-羟基丙 酸的绿色生物工艺，大幅度降低3-羟基丙酸的生产成本，是3-羟基丙酸大规模工业化生产 的前提。
[0004] 目前，生物法生产3-羟基丙酸的研究主要集中在以下三个方面：1)可直接产3-羟 基丙酸的野生菌的筛选和诱变;2)利用葡萄糖产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建;3)利用 甘油产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建。
[0005] 产3-羟基丙酸野生菌的筛选和诱变主要是集中在对假丝酵母的选育与诱变。利用 假丝酵母野生菌或者诱变菌产3-羟基丙酸需要以价格昂贵的丙酸为碳源，经济可行性较 差，且假丝酵母的基因工程改造比较困难。
[0006] 以葡萄糖为底物生产3-羟基丙酸存在不同的可能途径。Cargill公司以乳酸为中 间产物，经过丙酰CoA转移酶、乳酰CoA脱水酶和3-羟基丙酰水解酶的催化等三步反应生成 3-羟基丙酸。通过在大肠杆菌内引入这三个外源酶，并进一步进行系统代谢工程改造，3-羟 基丙酸的产量达到20g/L APXbio公司以乙酰CoA为代谢前体，经过乙酰CoA羧化酶和丙酰 CoA还原酶的催化生产3-羟基丙酸，经过基因工程改造，3-羟基丙酸的产量达到20g/L以上。 这一技术路线的主要缺点是大多数基因工程菌种对3-羟基丙酸的耐受性差，3-羟基丙酸产 量较低。
[0007] 利用甘油产3-羟基丙酸的基因工程菌的构建，主要通过在克雷伯氏肺炎杆菌或者 大肠杆菌中引入醛氧化酶将3-羟基丙醛氧化成3-羟基丙酸。这一技术路线的缺点是甘油的 价格相对较高，并且这一过程产生大量的副产物如1，3_丙二醇等。
[0008] 针对目前3-羟基丙酸生产工艺中存在的技术问题，特别是副产物多，原料成本高， 菌株对酸的耐受力差等问题，亟待开发一种生产3-羟基丙酸的新方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。
[0010] 本发明的另一目的是提供利用上述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产3-羟基丙酸的方 法。
[0011] 为了实现本发明目的，本发明提供一种产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌，所述 重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中过表达内 源的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA，并过表达甘油脱氢酶基因 gldA、甘油脱水酶及其 激活因子基因 pdu⑶EGH及3-羟基丙醛脱氢酶基因 aldH构建得到的。
[0012] 本发明所述甘油脱氢酶基因 gldA、3-羟基丙醛脱氢酶基因 aldH来源于大肠杆菌， 基因 gldA和aldH的核苷酸序列分别如SEQ ID N0:2和4所示;所述甘油脱水酶及其激活因子 基因 pdu⑶EGH来源于克雷伯氏肺炎杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示;所述磷酸二羟 基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0013] 除了表达来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶外，表达其他来源的甘油脱水酶同 样可以实现相同的功能。
[0014] 优选地，本发明使用的宿主菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
[0015]所述重组谷氨酸棒杆菌是将基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脱水酶及其激活因子 基因 pduCDEGH构建到原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中，构建得到的，或者将上 述基因整合到谷氨酸棒状杆菌基因组中构建得到的。
[0016] 在本发明的一个【具体实施方式】中，将基因 hdpA和gldA构建到大肠杆菌-谷氨酸棒 杆菌穿梭质粒pEC-K18mob2上，得到的重组载体命名为pEC-hdpA-gldA，然后用pEC-hdpA-gldA转化谷氨酸棒状杆菌，得到的重组菌命名为C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA;再将甘油 脱水酶及其激活因子基因 PduCDEGH以及基因 aldH构建到大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒 口父]\^19上，得到的重组载体命名为？乂]\^-31(1!11(111，用？乂]\^-3 1(1!11(111转化重组菌 C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA，筛选阳性克隆即得重组谷氨酸棒杆菌，命名为 C·glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu 〇
[0017] 本发明还提供所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，通过将基因 hdpA、gldA、aldH以 及甘油脱水酶及其激活因子基因 PduCDEGH构建到原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆 菌中，构建得到重组谷氨酸棒杆菌，或者将上述基因整合到谷氨酸棒状杆菌基因组中构建 得到重组谷氨酸棒杆菌。
[0018] 例如，可将基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH分别 构建到不同原核表达载体上，然后共同导入谷氨酸棒状杆菌中，构建得到重组谷氨酸棒杆 菌，或者将基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH分别构建到同 一原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中，构建得到重组谷氨酸棒杆菌。
[0019] 本发明进一步提供所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产3-羟基丙酸中的应用，所述 应用是以葡萄糖等可发酵糖为原料进行好氧发酵。
[0020] 在本发明的一个【具体实施方式】中，利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产3-羟基丙酸的 方法，包括以下步骤：
[0021] S1、种子液的制备
[0022] 将重组谷氨酸棒杆菌 C. glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu 在 LB 平板上 过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，28-35 °C (优选32 °C)、200rpm培养12小时，所得种子液的0D6QQ值为10-20。
[0023] 种子培养基的配方包括(g/L):葡萄糖 10-30,（NH4)2S〇4 2.0-10，K2HP〇4 0.5-3·0， MgS〇4 0.1-1.0，MnS〇4 0.005-0 .l，FeS〇4 0.005-0.1，玉米浆10-30,卡那霉素0.025,以水配 制。优选地，种子培养基的配方包括（g/L):葡萄糖25，（NH4) 2S〇4 5.0，K2HP〇4 1.5，MgS〇4 1.0，MnS〇4 0.005，FeS〇4 0.005,玉米浆30,卡那霉素0.025。
[0024] S2、发酵生产3-羟基丙酸
[0025]以10% (v/v)的接种量将种子液接种到2L发酵培养基中，发酵采用5L的发酵罐，控 制温度为28-35°C (优选32°C)，通气量为0.1-2vvm，调整转速使得溶氧水平保持在10%以 上，通过流加氨水控制pH值稳定在5-8，优选pH值6-7。发酵周期为32-72小时。
[0026]发酵培养基配方包括(g/L):葡萄糖10-10(^/1，（顺4)230410-30.(^/1，1(2冊04 1-2.5g/L，MgS〇4 0.1-1 .Og/L，MnS〇4 0.010-0. lg/L，FeS〇4 0.010-0. lg/L，玉米浆l-15g/L，生 物素0·0005-0. lg/L，盐酸硫胺素0·005-0· lg/L，维生素 B12 0·005-0· lg/L。优选地，发酵培 养基配方包括（g/L):葡萄糖 100,（NH4)2S〇4 30 ·0，Κ2ΗΡ〇4 2.5，MgS〇4 1.0，MnS〇4 0.010， FeS〇4 0.010，玉米浆15,生物素0.0005，盐酸硫胺素0.005，维生素 B12 0.005。
[0027] 前述的方法，发酵过程中通过向发酵培养基中流加补充碳源，可进一步提高3-羟 基丙酸的产量。
[0028] 本发明利用谷氨酸棒杆菌作为宿主菌，可以有效地解决高浓度3-羟基丙酸对菌体 的抑制问题。目前文献中所采用克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌等菌株对酸的耐受力差，当3-羟基丙酸浓度大于200mM-300mM时，3-羟基丙酸会对细胞的生长和代谢产生明显的抑制作 用。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的微生物，广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸和赖 氨酸的生产，谷氨酸棒杆菌能够耐受极高的酸浓度，例如利用谷氨酸棒杆菌能够高产达到 200-250g/L的谷氨酸或者赖氨酸。
[0029]本发明提出一条全新的3-羟基丙酸生物合成途径（图1)。首先，利用谷氨酸棒杆菌 内源的糖酵解途径将葡萄糖等可发酵糖转化成磷酸二羟基丙酮，后者在谷氨酸棒杆菌内源 的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶催化下生成二羟基丙酮。进一步通过在在谷氨酸棒杆菌内引入 外源的甘油脱氢酶将二羟基丙酮转化成甘油。甘油在甘油脱水酶及3-羟基丙醛脱氢酶的作 用下最终生成3-羟基丙酸。由于谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，例如利 用废弃糖蜜、蔗糖、淀粉水解液等，同时还可以使用廉价的玉米浆作为营养成分替代昂贵的 酵母粉，因此可以进一步降低原料的成本。
[0030] 本发明具有以下优点：
[0031] ( -）以重组谷氨酸棒杆菌作为3-羟基丙酸生产菌株，解决了生物安全性以及菌株 对酸的耐受性问题。同时发酵过程中的菌体可作为产品，用于饲料添加剂中。
[0032] (2)本方法副产物少，使终产物3-羟基丙酸的分离过程得到简化。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明利用重组谷氨酸棒杆菌生产3-羟基丙酸的代谢途径。
【具体实施方式】
[0034]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0035]以下实施例中使用的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-K18mob2、pXMJ19购自 Addgene。
[0036] 实施例1在Corynebacterium glutamicum中过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基 因 hdpA和来源于大肠杆菌的甘油脱氢酶基因 gldA
[0037] 以谷氨酸棒杆菌ATCC 1 30 3 2的基因组为模板，以引物11(1?六-?(5/-cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG-3 7 )和hclpA-RG7 -CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT-3')为引物进行PCR，获得hdpA基因（hdpA基因序 列如SEQ ID N0:1所示）约0.9kb并进行PCR产物纯化。以大肠杆菌MG1655的基因组为模板， 以引 物gldA-FG7 -CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC-37 )和gldA-RG7 -atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC-3')为引物进行PCR，获得gldA基因 (gldA基因序列如SEQ ID N0:2所示)约1.2kb并进行PCR产物纯化。将大肠杆菌-谷氨酸棒杆 菌穿梭质粒pEC-K18mob2(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI进行酶 切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hpdA片段和gldA片段一步连接到pEC_K18mob2上， 获得的重组质粒命名为pEC-hdpA-g 1 dA。利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-hdpA-g 1 dA通过电转化 转入到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻600 Ω，电容25yF(电击杯 宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素 LB平板上筛选获得重组菌，命名为(^11^11^11111/^(：-hdpA-gldA。
[0038] 实施例2过表达来源于克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子基因 pdu⑶EGH和来自大肠杆菌的3-羟基丙醛脱氢酶基因 aldH
[0039] 以克雷伯氏肺炎杆菌H R 5 2 6的基因组为模板，以引物p d u - F ( 5 '-GGAGGCCtgaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTG-37 )和pdu-lUS7-gctcggtacccggggatcctTTAAGCATGGCGATCCCGAAAT-3')为引物进行PCR，获得包括甘油脱水 酶及其激活因子的pduCDEGH操纵子片段(序列如SEQ ID N0:3所示)并进行PCR产物纯化。以 大肠杆菌H R 5 2 6的基因组为模板，以引物a 1 d Η - F ( 5 '-tgcatgcctgcaggtcgactCTGACGTTCACAAACTGCATATATCTGATAGAC-3')和aldH-RG'-TATATCTCCTTtcaGGCCTCCAGGCTTATCCA-3〇为引物进行PCR，获得3-羟基丙酸脱氢酶基因 aldH片段（序列如SEQ ID N0:4所示）并进行纯化。将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒 PXMJ19用Xbal进行酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将pduCDEGH操纵子片段和aldH 片段一步连接到PXMJ19上，获得的重组质粒命名为pXMJ-aldH-pdu。利用电穿孔仪(伯乐)将 pXMJ-aldH-pdu通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C. glutamicum/pEC-hdpA-gldA中，电击条 件如实施例1所述。在含5mg//L的氯霉素和25mg/L的卡那霉素 LB平板上筛选获得重组菌，命 名为 C.glutami cum/pEC-hdpA-g 1 dA/pXMJ-a 1 dH-pdu 〇
[0040] 实施例3利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产3-羟基丙酸
[0041 ] 将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC 13032以及重组菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA， C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu分别在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上 单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32°C200rpm培养12小时，所得种 子液的OD6QQ值为10。
[0042] 种子培养基的配方包括（g/L):葡萄糖25，（NH4)2S〇4 5.0，K2HP〇4 1.5，MgS〇4 1.0， MnS〇4 0.005，FeS〇4 0.005,玉米浆30,卡那霉素0.025。
[0043] 以10% (v/v)的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐， 控制温度为32°C，通气量为lvvm，调整转速使得溶氧水平保持在10%以上，通过流加氨水控 制pH值稳定在7.0左右。
[0044] 发酵培养基配方包括(g/L):葡萄糖100，（NH4)2S〇4 30.0，K2HP〇4 2.5，MgS〇4 1.0， MnS〇4 0.010，FeS〇4 0.010，玉米浆 15,生物素0.0005，盐酸硫胺素0.005，维生素 B12 0.005。
[0045] 发酵48小时，野生菌株ATCC 13032不产甘油以及3-羟基丙酸，C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA 产 48g/L 的甘油但不产 3-羟基丙酸。C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu产42g/L的3-羟基丙酸，转化率达到0.42g/g。
[0046] 上述发酵过程中，通过向发酵培养基中流加补充碳源，可进一步提高3-羟基丙酸 的产量。
[0047]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是通过在 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中过表达内源的磷酸二羟基丙酮磷酸酯 酶基因 hdpA，并过表达甘油脱氢酶基因 gldA、甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH及3-羟基丙醛脱氢酶基因 aldH构建得到的。2. 根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述甘油脱氢酶基因 gldA、 3-羟基丙醛脱氢酶基因 aldH来源于大肠杆菌，基因 gldA和aldH的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 2和4所示;所述甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH来源于克雷伯氏肺炎杆菌，其核 苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;所述磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌为 ATCC 13032〇4. 根据权利要求1-3任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将基因 hdpA、gldA、 aldH以及甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH构建到原核表达载体上，然后导入谷氨酸 棒状杆菌中，构建得到重组谷氨酸棒杆菌，或者将上述基因整合到谷氨酸棒状杆菌基因组 中构建得到重组谷氨酸棒杆菌。5. 根据权利要求4所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将基因 hdpA和gldA构建到大 肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-K18mob2上，得到的重组载体命名为pEC-hdpA-gldA，然 后用pEC-hdpA-gldA转化谷氨酸棒状杆菌，得到的重组菌命名为C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA; 再将甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH 以及基因 aldH 构建到大肠杆菌-谷氨酸 棒杆菌穿梭质粒PXMJ19上，得到的重组载体命名为pXMJ-aldH-pdu，用pXMJ-aldH-pdu转化 重组菌C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA，筛选阳性克隆即为重组谷氨酸棒杆菌。6. 权利要求1-5任一项所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，将基因 hdpA、 gldA、aldH以及甘油脱水酶及其激活因子基因 pduCDEGH构建到原核表达载体上，然后导入 谷氨酸棒状杆菌中，构建得到重组谷氨酸棒杆菌，或者将上述基因整合到谷氨酸棒状杆菌 基因组中构建得到重组谷氨酸棒杆菌。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脱水酶及 其激活因子基因 PduCDEGH分别构建到不同原核表达载体上，然后共同导入谷氨酸棒状杆菌 中，构建得到重组谷氨酸棒杆菌，或者将基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脱水酶及其激活因 子基因 pduCDEGH分别构建到同一原核表达载体上，然后导入谷氨酸棒状杆菌中，构建得到 重组谷氨酸棒杆菌。8. 权利要求1-5任一项所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产3-羟基丙酸中的应用，所述 应用是以可发酵糖为原料进行好氧发酵。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所用发酵培养基配方为：葡萄糖IO-100g/ Lj(NH4)2SO4 10-30.Og/L,K2HPO4 1-2.5g/L,MgSO4 0.1-1.Og/L,MnSO4 0.010-0.lg/L,FeSO4 0.010-0. lg/L，玉米浆l-15g/L，生物素0.0005-0. lg/L，盐酸硫胺素0.005-0. lg/L，维生素 B12 0.005-0.lg/L； 发酵条件为：以10%的接种量将种子液接种到2L发酵培养基中，发酵米用5L的发酵罐， 控制温度为28-35°C，通气量为0.1-2vvm，调整转速使得溶氧水平保持在10%以上，通过流 加氨水控制pH值稳定在5-8，发酵周期30-72小时。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，发酵过程中通过向发酵培养基中流加 补充碳源，进一步提高3-羟基丙酸的产量。
【文档编号】C12P7/42GK105950529SQ201610474970
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】陈振, 刘德华
【申请人】清华大学, 东莞深圳清华大学研究院创新中心