一种黑曲霉菌株及其应用
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，公开了一种黑曲霉菌株，经鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)Z?9，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11130。还公开了该黑曲霉的应用，其通过发酵可产生纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，可用于制备纤维素酶、木聚糖酶或果胶酶制剂，也可用于制备至少包括纤维素酶、木聚糖酶或/和果胶酶的复合酶制剂，扩展了其在饲用酶制剂的应用范围；能用于生物发酵饲料，可以有效改质果渣类物质为生物蛋白饲料，提升果渣的附加值，为果渣等渣类物质的饲料化应用提供优良材料，制备的生物蛋白饲料在奶牛、羊和仔猪等饲养动物上具有良好的应用效果。CGMCC No.1113020150812
【专利说明】
一种黑曲霉菌株及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种黑曲霉菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 饲用酶制剂是一种以酶为主要功能因子、通过特定生产工艺加工而成的饲料添加 剂。上世纪中叶随着对酶蛋白的结构、酶动力学、酶的作用方式及酶的合成和调控机制研究 的加深，酶制剂的研究及生产也得以迅速发展。Jesen在家禽的大麦日粮中使用粗酶制剂， 明显提升了日粮的饲喂效果，提高了家禽的生长性能，至此各国拉开了饲用酶研究的序幕。 1975年，美国Kemin公司推出了商品饲用酶制剂，标志着外源酶作为饲料添加剂开始登上历 史舞台。九十年代起适用于不同动物以及不同饲料的复合酶开始大量应用，欧洲饲料中添 加 β-葡聚糖酶达90%以上，世界范围内以大麦和小麦为基质的禽饲料中添加率为60%，猪 饲料添加率达80 %。
[0003] 饲用酶制剂的酶来源是植物、动物和微生物。动植物含酶组织也能分泌多种水解 酶，主要通过提取来获得，但数量有限、开发成本高，容易受生长季节的影响，因此，主要应 用于科研实验和医药。饲用酶制剂主要是通过生产工艺简单、产量高、成本低的微生物发酵 获得的。如黑曲霉（Aspergillus niger)、绿色木霉（Trichoderma viride)和斜卧青霉 (Penicillium decumbens)等能够生产纤维素酶;芽孢杆菌和曲霉能生产酸性α-淀粉酶;黑 曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等能产生酸性蛋白酶;一些酵母 和曲霉能产生果胶酶。
[0004] 已发现的酶种类达千余种，用于实际生产的酶有300多种，有20多种被用于饲料酶 制剂。酶的分类也因应用目的和方式不同而存在不同的类别，按酶实际代谢底物的类型，可 以分为碳水化合物酶、蛋白酶和植酸酶;按照动物机体内外酶的区别，消化酶可分为内源和 非内源两大类;按照添加酶的种类可以分为单一酶制剂和复合酶制剂等。由于酶具有专一 性和特异性，单一酶制剂的应用效果往往不如复合酶制剂，因此，目前多使用包含非内源性 酶的复合酶制剂。复合酶制剂是针对不同底物含有多种消化酶的复合型制剂，根据喂养动 物及饲料原料的差异，复合酶制剂有不同的复合产品。
[0005] 目前，复合酶制剂的生产主要通过多种单一酶制剂掺混或者多种产酶菌株发酵得 到，而产多酶单一菌株发酵生产复合酶制剂的报道较少。其中单一酶制剂掺混的方法增加 了复合酶制剂生产过程中的酶的提纯和掺混过程，增加了劳动量和成本;多种产酶菌株混 合发酵方法主要依靠不同菌株之间的协同作用对原料和发酵条件有更高的要求;多酶单一 菌株发酵生产复合酶是最简单易实现的方法，但需大力开发产复合酶的优良菌株。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种黑曲霉菌株及其应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
[0008] 一种黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株为黑曲霉(Aspergillus niger) Z-9,于2015年08月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 为:CGMCC No. 11130,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，邮编为100101。
[0009] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在PDA琼脂培养基上，25°C黑暗条件下培养7 天，菌落直径70mm，初期质地近绒毛状，菌落圆形、平坦、浓密、粗壮、整齐，后因产孢子而带 粉粒状。
[00?0] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在扫描电镜下，其菌丝有横隔，分生孢子头 球性至辐射形，顶囊球形或近球形，直径20~40μπι，全部表面可育;产孢子结构双层，梗基10 ~20(长度）Χ4.5~7(直径)μπι，瓶梗6~9(长度）Χ2.5~3(直径)μπι，分生孢子球形或近球 形，直径3~4.5μπι，褐色，壁稍粗糙。
[0011]所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z_9的5.8S rDNA序列如SEQ ID Ν0:1 所示，具体 为：
[0012] CTGGACTACTGATCGAGGTCACCTGGACAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTG ACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACG GCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCG CAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCA TCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCA GACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGC GGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCC TTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGCT。
[0013] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在通过发酵制备纤维素酶、木聚糖酶或果胶 酶制剂中的应用。
[0014] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在以作物猜杆为碳源，通过液体发酵制备纤 维素酶、木聚糖酶或果胶酶制剂中的应用。
[0015] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在通过固态发酵制备纤维素酶、木聚糖酶或 果胶酶制剂中的应用。
[0016] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在制备至少包括纤维素酶、木聚糖酶或/和 果胶酶的复合酶制剂中的应用。
[0017]所述黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在制备生物发酵饲料中的应用。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0019] 本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9不仅可以产纤维素酶，还有较高的果胶 酶和木聚糖酶活力，是一种产多酶系的黑曲霉菌株。
[0020] 本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9采用固态发酵的方式，产酶效果更好， 纤维素酶含量高，酶系完全具有广谱的酶活性;设备简单，操作方便;发酵培养基简单，主要 以农副产品为主，原料来源广泛，价格低廉，且生产过程中无废物产生，不存在环境污染的 问题;降低了该产酶菌株在实际开发应用中的难度，扩展了其在饲用酶制剂的应用范围。 [00 21]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9能用于生物发酵饲料，可以有效改质果 渣类物质为生物蛋白饲料，提升果渣的附加值，为果渣等渣类物质的饲料化应用提供优良 材料。
[0022]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9改质的苹果渣生物蛋白饲料在奶牛、羊 和仔猪等饲养动物上具有良好的应用效果。
【附图说明】
[0023]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0024] 图1为本发明的一种黑曲霉Z-9在PDA琼脂培养基上的菌落形态示意图；
[0025] 图2为本发明的一种黑曲霉Z-9的菌丝在扫描电镜下的形态示意图；
[0026] 图3为本发明的一种黑曲霉Z-9的顶囊在扫描电镜下的形态示意图；
[0027] 图4为本发明的一种黑曲霉Z-9的分生孢子在扫描电镜下的形态示意图；
[0028] 图5为本发明的一种黑曲霉Z-9的系统发育树。
【具体实施方式】
[0029]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将 会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
[0030] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 实施例1
[0032] (1)菌株的获得
[0033] 分离筛选自太白山土壤腐殖层，分离筛选所采用的培养基为羧甲基纤维素钠筛选 培养基，具体成分如下:羧甲基纤维素钠 l〇.〇g，KH2P〇4 1.0g，NaCl 0.1g，MgS〇4 7H20 0.3g， NaN03 2.5g，FeCl3 0.001g，CaCl2 O.lg，刚果红0.2g，琼脂 18g，H20 1000mL，pH自然。
[0034] (2)菌株的培养学特征
[0035] 本发明的黑曲霉菌株在PDA琼脂培养基上，25 °C黑暗条件下培养7d，菌落直径 70_，初期质地近绒毛状，菌落圆形、平坦、浓密、粗壮、整齐，后因产孢子而带粉粒状，如图1 所示。其中，PDA琼脂培养基的成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH 自然。
[0036] (3)菌株的形态学特征
[0037] 将黑曲霉菌置于扫描电镜下观察可知，其菌丝有横隔（如图2所示）；分顶囊球形或 近球形(如图3所示），直径20~40μπι，全部表面可育;产孢子结构双层，梗基10~20(长度）X 4.5~7(直径)μπι，瓶梗6~9(长度）X 2.5~3(直径)μπι，分生孢子球形或近球形（如图4所 示），直径3~4.5μπι，褐色，壁稍粗糙。
[0038] (4)菌株的5.8SrDNA序列分析
[0039] 采用石英砂研磨法提取黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌丝DNA，然后选用通用 引物ITS1和ITS4序列进行PCR扩增，PCR反应产物经1%琼脂(Biowest)凝胶检测，检测后送 测序公司进行测序，得到本发明的黑曲霉的5.8S rDNA序列为：
[0040] CTGGACTACTGATCGAGGTCACCTGGACAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTG ACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACG GCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCG CAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCA TCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCA GACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGC GGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCC TTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGCT，在NCBI提交该核酸序列，进行对比分析，确认该 菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，并命名为黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9,其系统发 育树见图5。
[0041 ] 实施例2
[0042]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌株能以作物猜杆为碳源，通过液体发 酵产生纤维素酶，液态发酵培养方法为:采用打孔法，将产黑曲霉孢子的菌块接入到灭菌后 的80mL液体发酵培养基中，200r/min、30°C摇床培养5天，获得含纤维素酶发酵液，含纤维素 酶发酵液经8000r/min离心和抽滤，即得粗酶液;其中，液体发酵培养基的成分为:麦秸粉 2g，麸皮20g，微晶纤维素 6g，豆饼粉5g，硫酸铵2g，尿素lg，硝酸钠 2g，硫酸二氢钾3g，硫酸镁 0 · 5g，吐温803mL，自来水1 OOOmL，pH值自然。
[0043] 粗酶液经测定，其中纤维素酶滤纸酶活(FPA)为64.67U/mL，同时含有木聚糖酶、果 胶酶，酶活分别为216.70U/mL、66.91 U/mL，FPA酶活的测定方法为DNS法。
[0044] 需要说明的是，本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9可应用于通过液体发酵 制备纤维素酶、木聚糖酶或果胶酶制剂。
[0045] 实施例3
[0046] 黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9孢子制剂的制备：称取50g麸皮于650ml组培瓶 中，加入60ml自来水，121°C灭菌30min，冷却后接种5ml黑曲霉孢子悬液，搅拌均勾，用四层 无菌纱布封口，置28°C下丨旦温培养，培养24h后菌丝开始大量生长，培养36h后菌丝布满发酵 基质，培养56h后表层开始长出孢子，培养96h后长满孢子。取样检测结果表明，黑曲霉 (Aspergillus niger)Z-9孢子萌发率达到99.5%，该黑曲霉孢子具有易制备、易成活和易 培养等特点。
[0047] 实施例4
[0048]本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌株通过固态发酵产生固态复合酶制 剂，固态发酵培养方法为：在三角瓶中，用TOA琼脂培养基培养黑曲霉Z-9至长出大量孢子， 再用80ml无菌水洗脱孢子制得黑曲霉孢子悬液，并将黑曲霉孢子悬液接入到50g灭菌后的 固体发酵培养基中，30°C恒温培养3天，发酵产物放于干燥阴凉环境下晾干，然后于40°C低 温下烘干并粉碎，即得固态复合酶制剂;其中，固态发酵培养基成分为:麦秸粉27.5g，麸皮 你5g，豆柏17.5g，75ml Mendels盐溶液，pH自然。
[0049] 称取0.500g固态复合酶制剂于15mL离心管中，加蒸馏水1 OmL，40°C水浴中保温 45min，再在4000r/min条件下离心5min，取上清液即为粗酶液;对粗酶液进行测定，测得粗 酶液中的纤维素酶活为:羧甲基纤维素(CMC)酶5196.05U/g、FPA酶617.04U/g;木聚糖酶活 为1318.25U/g，果胶酶活为 584.90U/g。
[0050] 需要说明的是，本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9也可应用于通过固态发 酵制备纤维素酶、木聚糖酶或果胶酶制剂。
[0051 ] 实施例5
[0052]对本发明的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌株通过固态发酵得到的固态复合 酶制剂进行大鼠急性经口毒性试验，选取SD大鼠20只（雌雄各半），体重180~220g，禁食(不 禁水)16小时后，用浓度为13 %的酶制剂溶液，按4mL/200g体重的给药量灌胃给药，一天共2 次，给药后观察动物的活动、皮毛、饮食、粪便均无异常改变，亦无中毒症状及死亡情况，连 续观察2周；2周后复称体重，处死动物进行解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑、 舌、胃、肠、膀胱、性腺(子宫、卵巢和睾丸和附件睾）等主要脏器均无异常变化，表明该菌株 及其发酵产物不含有害物质，安全、无毒、无副作用。
[0053] 实施例6
[0054]黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌株在生物发酵饲料中的应用效果:准确称取质 量配比为苹果渣：油渣粉:尿素=17:2:1的混合固态发酵原料50.0g装入650mL组培瓶中，加 入7 5mL mande 1 s复合盐溶液，混勾，121°C下湿热灭菌30m i η。待培养基冷却后，分别接入3mL 酵母菌悬液和3mL黑曲霉菌孢子悬液，不接菌为对照(CK)，每个处理重复3次。将接种并搅匀 的培养基置于28°C恒温培养箱中培养72h后，将发酵样品于40°C低温烘干至质量恒定，最后 将样品粉碎，测定纤维素酶、果胶酶和蛋白酶活，水溶性氨基酸、多肽和还原糖含量。
[0055] 其中，黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9孢子悬液的制备：将28°C活化的霉菌斜面 菌种用无菌水配制成菌悬液，接种至装有灭菌TOA固体培养基的三角瓶中，28°C培养72h后 向三角瓶中加入200mL无菌生理盐水，摇动制成孢子悬液，采用血球计数法测定孢子数，并 用无菌水稀释至10 8cfu · ml/1。
[0056] 酵母菌悬液制备：按照无菌操作法向100mL灭菌YEPD液体培养基中接入产阮假丝 酵母菌，28°C摇瓶150r · mirT1培养72h，采用血球计数法测定细胞数，并用无菌水稀释至 108cfu · mL_1〇
[0057] 纤维素酶活、木聚糖酶活和果胶酶活测定采用DNS法(杨涛2006,李忠福2002);纯 蛋白的测定采用凯氏定氮法（贺克勇2004);纤维素的测定方法采用GB/T20806-2006;果胶 的测定采用果胶酸沉淀法(曹德菊2000);水溶性氨基酸的测定采用茚三酮比色法，水溶性 还原糖采用DNS比色法;水溶性多肽采用考马斯亮蓝比色法(高俊凤2000)。
[0058] 黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9菌株发酵苹果渣产物中纤维素酶、木聚糖酶、果 胶酶活性分别为623.5U · g-\525.3U · g-1和301.2U · g-S纯蛋白达到230.4g · kg-S纤维素 和果胶分别较纯苹果渣降低了 29.3 %和45.9 % ;水溶性还原糖较纯果渣增加了43.8% ;水 溶性多肽和氨基酸分别增加至〇.89g · kg<和18.73g · kg<，较好地改质苹果渣为生物蛋白 饲料，在发酵饲料生产中具有广阔的应用前景。
[0059] 实施例7
[0000]以黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9为菌剂生产的苹果渣生物蛋白饲料在奶牛、奶 山羊和仔猪上的应用效果:应用在奶牛上，苹果渣生物蛋白饲料能使牛奶的产量增加2.0~ 3.0kg/头/天，同时提高牛奶中乳蛋白含量;应用在奶山羊上，奶产量可以达到15~25%的 增幅，并显著的提高脂肪、非脂固形物、密度、蛋白质、冰点、乳糖、灰分等指标含量，改善山 羊奶品质;应用在仔猪上，苹果渣生物蛋白饲料能补充内源消化酶，提升仔猪对饲料的消化 利用效率，仔猪采食量和日增重分别增加了 2.5 %和4.9 %，料肉比下降2.7 %。
[0061] 上述结果表明以黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9为菌剂生产的苹果渣生物蛋白 饲料具有良好品质，黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在生物发酵饲料中具有较高的应用价 值。
[0062]虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范 围。
【主权项】
1 ·一种黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)z-9,于2015年08月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.11130。2. 根据权利要求1所述的黑曲霉菌株，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillus niger) Z-9的5.8S rDNA序列为： CTGGACTACTGATCGAGGTCACCTGGACAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCA TGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGG GACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGG GGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTC TTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCT TTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAG CGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATG ATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGCT。3. 权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在通过发酵制备纤维素酶、木聚 糖酶或果胶酶制剂中的应用。4. 权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在以作物猜杆为碳源，通过液体 发酵制备纤维素酶、木聚糖酶或果胶酶制剂中的应用。5. 权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在通过固态发酵制备纤维素酶、 木聚糖酶或果胶酶制剂中的应用。6. 权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在制备至少包括纤维素酶、木聚 糖酶或/和果胶酶的复合酶制剂中的应用。7. 权利要求1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)Z-9在制备生物发酵饲料中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK106085881SQ201610545330
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】李海洋, 来航线, 韦小敏, 李肖, 薛泉宏
【申请人】西北农林科技大学