一种用于监测肿瘤转移过程的仿生微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于临床应用领域，涉及一种用于监测肿瘤转移过程的仿生微流控芯片。本实用新型的微流控芯片可以动态监测肿瘤细胞的转移过程，定义肿瘤细胞的迀移模式，为预防和治疗肿瘤转移提供指导。
【背景技术】
[0002]癌细胞转移是包括肺癌在内的所有癌症死亡的主要原因，属于基础研宄者和临床学者的最大挑战之一。癌细胞转移是一个复杂的生理过程，通常包括主位点肿瘤病变增殖、肿瘤细胞脱离、肿瘤细胞迀移、溢出并在第二器官处形成转移性的肿瘤细胞团。具有转移性表型的肿瘤细胞表现出以下性质:细胞移动性增强、降解基底膜组分的能力增强、向周围细胞迀移的能力增强、穿透淋巴管或者血管的能力增强、在第二位点自主增殖的能力增强。然而，肿瘤细胞迀移具有高度器官选择性、该过程涉及肿瘤细胞和宿主器官之间的相互作用。到目前为止，器官特异性的肿瘤转移的精确机制还未完全研宄清楚。
[0003]肺癌是世界上癌症死亡的最主要因素，癌症细胞转移到远处的器官是肺癌死亡的主要起因。临床结果显示，肺癌经常转移到脑组织、骨组织和肝脏组织中。更好的了解肺癌转移模式对于制定针对肺癌病人的治疗策略是非常关键的。因此，发展一种在体外能够模拟肺癌转移体内微环境的体外细胞培养模型是亟待解决的问题。
[0004]了解肺癌细胞转移的病理学需要在整个具有生理活性的肺和远处器官的环境下研宄具有生理活性的癌症细胞和组织的功能。然而，目前存在的用于评价正常生理和疾病过程的动物模型是十分昂贵的，并且实验周期很长，同时还存在多种伦理争议。更为重要的是，上述动物模型不能很好的控制转移的肺癌细胞的定位和趋向性，从而导致不能正确的反应人类体内肺癌细胞转移的生理状态。近年来，一种体外3D细胞培养模型得到了越来越广泛的应用。上述体外3D细胞培养模型已经被用于多种肿瘤细胞和间质细胞的共培养。这些模型可以容易控制条件去研宄旁分泌信号对不同类型细胞之间的影响。发明人在现有的3D细胞培养模型基础上进行升级和改造，开发了可以用于模拟体内肺癌转移微环境的仿生微流控芯片。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本实用新型提供了一种用于监测肿瘤转移过程的微流控芯片。该微流控芯片中可以将不同细胞进行共培养，动态监测上游肿瘤细胞向下游靶器官转移的过程，为临床制定肿瘤治疗方案提供基础。
[0006]本实用新型的上述微流控芯片采用了如下设计方案:
[0007]本实用新型的微流控芯片是由三层PDMS基片和两层多孔PDMS膜相互交错不可逆的封接而成的一个密闭整体；第一层PDMS基片I上设有供空气流通的空气通道11、供液体进出的第一层液体入口 12和第一层液体出口 13，分别位于所述空气通道11两侧的第一真空通道14的上半部分和第二真空通道15的上半部分；第二层PDMS基片2上设有供液体流通的液体通道21、供液体进出的第二层液体入口 22和第二层液体出口 23，分别位于所述液体通道21两侧的所述第一真空通道14的下半部分、所述第二真空通道15的下半部分，所述液体通道21的侧边上设有三条向外延伸的连接通道，分别为第一连接通道211、第二连接通道212、第三连接通道213，所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213的末端分别设有第一入口 214、第二入口 215、第三入口 216 ;第三层PDMS基片3上设有供细胞培养的第一细胞培养室31、第二细胞培养室32、第三细胞培养室33 ;所述第一细胞培养室31、所述第二细胞培养室32、所述第三细胞培养室33分别位于所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213的下方，通过第一多孔PDMS膜5与所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213相通；所述第一真空通道14的上半部分、所述第二真空通道15的上半部分和所述第一真空通道14的下半部分、所述第二真空通道15的下半部分结构相对应形成结构完整的所述第一真空通道14和所述第二真空通道15 ;所述第一层液体入口 12和所述第一层液体出口 13分别设置于所述空气通道11的上下游且同侧；所述第二层液体入口 22和所述第二层液体出口 23分别设置于所述液体通道21的上下游且同侧，所述空气通道11位于所述液体通道21的正上方，所述空气通道11的开口与所述液体通道21的开口相对且通过第二多孔PDMS膜4隔开；所述空气通道11覆盖在所述液体通道21的上游端，所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213位于所述液体通道21的下游端。
[0008]进一步，所述多孔PDMS膜的厚度为10 μ m、孔径为10 μ m。
[0009]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，所述空气通道11和所述液体通道21的横截面为长方形，尺寸为:高5mm、宽4mm ;所述第一真空通道14、第二真空15的横截面为长方形，尺寸为:高7mm、宽2mm ;所述第一细胞培养室31、所述第二细胞培养室32、所述第三细胞培养室33的横截面形状为长方形，尺寸为:高1.5mm、宽1.5mm。
[0010]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，所述空气通道11的长度为1mm;所述液体通道21的长度为35mm ;所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213距离所述液体通道21的一端的距离是2.2mm。
[0011]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，所述第一层液体入口 12和所述第一层液体出口 13的距离是15mm ;所述第二层液体入口 22和所述第二层液体出口 23的距离是15mm0
[0012]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，所述第一连接通道211、所述第二连接通道212、所述第三连接通道213相互平行。
[0013]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，所述第一真空通道14与所述空气通道11的距离是2mm ;所述第二真空通道15与所述空气通道11的距离是2mm。
[0014]本实用新型的微流控芯片上所有通道是设置于基片上的沟槽；本实用新型的微流控芯片上的细胞培养室是设置于基片上的凹槽。
[0015]构成微流控芯片上下两层基材的材料可以是PDMS (聚二甲基硅氧烷)、PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)、PC(聚碳酸酯)、COC树脂、ABS(丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物)、玻璃、石英或铜。在本实用新型的具体实施方案中，所述基材I和基材2的制备材料选用PDMS。
[0016]本实用新型的微流控芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
[0017](I)制备具有上述微流控芯片中微通道和微结构的SU-8阳模；
[0018](2)以步骤(I)制备的SU-8阳模为模板，以PDMS为原料复制，制备成第一层PDMS基片、第二层PDMS基片、第三层PDMS基片；
[0019](3)制备两张上述微流控芯片中的多孔PDMS膜；
[0020](4)将步骤(2)制备的所述第一层PDMS基片、所述第二层PDMS基片、所述第三层PDMS基片和步骤(3)制备的两张所述多孔PDMS膜相互交错放置封接而成。
[0021]进一步，在本实用新型的具体实施方案中，本实用新型的微流控芯片的制备方法如下:
[0022](I)用计算机辅助设计软件CAD绘制上述微流控芯片中的微通道、微结构图；将图打印在SU-8胶片(Microchem，型号为2075)上作为掩膜，采用标准光刻工艺制作模具，标准光刻工艺为本领域技术人员熟知；
[0023](2)将PDMS (Dow Corning，货号:0007883528)和固化剂按质量比10:1混匀，在真空干燥箱抽真空之后浇涂在步骤(I)制备的模具表面，80°C烘烤Ih ;
[0024](3)冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相应位置钻出入口、出口，然后切割成合适大小；
[0025](4)多孔PDMS膜制作是PDMS和固化剂按质量比15:1混匀，匀胶机3000rpm，I分钟，抽真空之后浇涂在步骤(I)制备的模具表面，65°C烘制过夜；冷却后缓慢将PDMS在模板上撕下，备用。
[0026]Su-8光刻技术:新型的化学增幅型负像SU-8光刻胶克服了普通光刻胶采用UV光刻深宽比不足的问题，十分适合于制备高深宽比微结构，因此SU-8胶是一种负性、环氧树脂型、近紫外线光刻胶。它在近紫外光(365nm-400nm)范围内光吸收度很低，且整个光刻胶层所获得的曝光量均匀一致，可得到具有垂直侧壁和高深宽比的厚膜图形；它还具有良好的力学性能、抗化学腐蚀性和热稳定性；SU-8在受到紫外辐射后发生交联，是一种化学扩大负性胶，可以形成台阶等结构复杂的图形；且SU-8胶不导电，在电镀时可以直接作为绝缘体使用。由于它具有较多优点，SU-8胶正被逐渐应用于MFMS、芯片封装和微加工等领域。直接采用SU-8光刻胶来制备深宽比高的微结构与微零件是微加工领域的一项新技术。
[0027]使用本实用新型的微流控芯片监测体内肿瘤细胞转移过程的操作步骤如下:
[0028]1、实质模拟:将上皮细胞和肿瘤细胞共培养于微流控芯片中的多孔PDMS膜4接触空气的一面。
[0029]2、间质模拟:将血管内皮细胞和间质细胞(例如成纤维细胞、单核细胞)共培养于微流控芯片中多孔PDMS膜4接触液体的一面。
[0030]3、肿瘤细胞转移靶器官模拟:将脑组织细胞、骨组织细胞、肝组织细胞分别在微流控芯片中细胞培养室31、32、33中进行3D培养。
[0031]4、进行体外构建的肺癌转移微环境的有效性检测
[0032]通过检测细胞的活力，血管内皮细胞和上皮细胞连接的紧密性，肿瘤细胞诱导的癌相关成纤维细