多孔膜上的肺癌细胞；
[0122]b、使用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分钟，PBS溶液清洗2次；
[0123]C、将封闭血清稀释液注入芯片培养池中，放入湿盒内，37°C孵育I小时。用新鲜配制的5% BSA稀释羊封闭血清原液，按照1:100的比例稀释，用振荡器混匀；
[0124]d、使用抗人E妈粘蛋白抗体(1: 100, Proteintech)，抗人N妈粘蛋白的抗体(5 μ g/ml, abeam)、抗人Snaill蛋白的抗体(1:50, abeam)、抗人Snail2蛋白的抗体(1:400，Cell Signaling Technology)，孵育 2h ;
[0125]f、使用Alexa 488或者594偶联的二抗孵育Ih ;使用终浓度为10 μ g/mL的DAPI染色，时间为15min ;使用荧光显微镜照相。
[0126]1.2转移性肺癌细胞生长模式的鉴定
[0127]使用C34557标记肺癌细胞；将C34557工作液(10 ymol/L)加入到1640细胞培养基中，将细胞孵育20min ;之后使用新鲜培养基孵育5min，重复4次。(事先用细胞示踪剂C34557将肺癌细胞标记为绿色:芯片接种前将肺癌细胞重悬于C34557工作液中(1umol/L)37°C孵育20min，后重悬于4倍体积培养基中37°C孵育5min)。
[0128]1.3检测转移性肺癌细胞的侵袭
[0129]通过检测组织损伤标记蛋白的表达来评价转移性的肺癌细胞是否能够侵袭进入微流控芯片多个远端器官中。使用抗人脑组织损伤标记蛋白CXCR4的抗体(1: 100, abeam)、抗人骨组织损伤标记蛋白RANKL抗体(1:50，Santa Cruz B1technology)、抗人肝组织损伤标记蛋白AFP抗体进行免疫染色。
[0130]免疫染色过程如下:
[0131]a、使用PBS清洗细胞2次；
[0132]b、使用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.5% PBST溶液破膜10分钟，PBS溶液清洗2次；
[0133]C、将封闭血清稀释液注入芯片培养池中，放入湿盒内，37°C孵育I小时。用新鲜配制的5% BSA稀释羊封闭血清原液，按照1:100的比例稀释，用振荡器混匀；
[0134]e、使用上述一抗，孵育2h ；
[0135]f、使用Alexa 488或者594偶联的二抗孵育Ih ;使用终浓度为10 μ g/mL的DAPI染色，时间为15分钟；使用荧光显微镜照相。
[0136]2、实验结果
[0137]2.1肺癌细胞上皮-间质转化
[0138]肺癌细胞和癌症相关的间质细胞长时间培养4d后，肺癌细胞表达EMT，3种EMTmarker (N-Ca、Snail1、Snail2)表达表明肺癌细胞已发生上皮细胞间质转化(图12)。
[0139]2.2肺癌细胞远距离转移
[0140]细胞计数可知，非小细胞肺癌细胞A549粘附到脑组织细胞、骨组织细胞、肝组织细胞上部多孔膜上的细胞数量分别是148±8个、364±16个、299±13个；小细胞肺癌细胞H446粘附到脑组织细胞、骨组织细胞、肝组织细胞上部多孔膜上的细胞数量分别是255±16个、128±8个、278±18个(图13)。上述结果表明A549细胞转移的趋向性是骨组织 > 肝组织 > 脑组织；H446细胞转移的趋向性是肝组织 > 脑组织 > 骨组织，这些特征和肺癌病人的临床特征相似。
[0141]2.3转移性的肺癌细胞在多个远端器官处的生长模式
[0142]用倒置荧光显微镜观察细胞形态。如图14所示，转移到远端靶器官的细胞形态是成团。
[0143]2.4转移性肺癌细胞的侵袭
[0144]结果如图15所示，星型胶质细胞H1800中表达CXCR4、成骨细胞Fob中表达RANKL、肝细胞L-02中表达AFP，表明转移性肺癌细胞已经侵袭到靶器官细胞中。
[0145]通过上述实施例，发现本实用新型的微流控芯片能够有效地模拟体内肺癌细胞的转移和侵袭过程，为临床制定治疗方案提供基础。
[0146]综上所述，本实用新型的实施方式仅提供最佳的实施方式，本实用新型的技术内容及技术特点已揭示如上，然而熟悉本项技术的人士仍可能基于本实用新型所揭示的内容而作各种不背离本实用新型创作精神的替换及修饰；因此，本实用新型的保护范围不限于实施例所揭示的技术内容，故凡依本实用新型的形状、构造及原理所做的等效变化，均涵盖在本实用新型的保护范围内。
【主权项】
1.一种用于监测肿瘤转移过程的仿生微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片是由三层PDMS基片和两层多孔PDMS膜相互交错不可逆的封接而成的一个密闭整体；第一层PDMS基片(I)上设有供空气流通的空气通道(11)、供液体进出的第一层液体入口(12)和第一层液体出口(13)，分别位于所述空气通道(11)两侧的第一真空通道(14)的上半部分和第二真空通道(15)的上半部分；第二层PDMS基片(2)上设有供液体流通的液体通道(21)、供液体进出的第二层液体入口(22)和第二层液体出口(23)，分别位于所述液体通道(21)两侧的所述第一真空通道(14)的下半部分、所述第二真空通道(15)的下半部分，所述液体通道(21)的侧边上设有三条向外延伸的连接通道，分别为第一连接通道(211)、第二连接通道(212)、第三连接通道(213)，所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)的末端分别设有第一入口(214)、第二入口(215)、第三入口(216);第三层PDMS基片(3)上设有供细胞培养的第一细胞培养室(31)、第二细胞培养室(32)、第三细胞培养室(33);所述第一细胞培养室(31)、所述第二细胞培养室(32)、所述第三细胞培养室(33)分别位于所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)的下方，通过第一多孔PDMS膜(5)与所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)相通；所述第一真空通道(14)的上半部分、所述第二真空通道(15)的上半部分和所述第一真空通道(14)的下半部分、所述第二真空通道(15)的下半部分结构相对应形成结构完整的所述第一真空通道(14)和所述第二真空通道(15);所述第一层液体入口(12)和所述第一层液体出口(13)分别设置于所述空气通道(11)的上下游且同侧；所述第二层液体入口(22)和所述第二层液体出口(23)分别设置于所述液体通道(21)的上下游且同侧，所述空气通道(11)位于所述液体通道(21)的正上方，所述空气通道(11)的开口与所述液体通道(21)的开口相对且通过第二多孔PDMS膜(4)隔开；所述空气通道(11)覆盖在所述液体通道(21)的上游端，所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)位于所述液体通道(21)的下游端。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一多孔PDMS膜(4)和所述第二多孔PDMS膜(5)的厚度为10 μ m、孔径为10 μ m。3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述空气通道(11)和所述液体通道(21)的横截面为长方形，尺寸为:长1mmX宽4mm，长35mmX宽4mm ;所述第一真空通道(14)、所述第二真空通道(15)的横截面为长方形，尺寸为:长7mm、宽2mm ;所述第一细胞培养室(31)、所述第二细胞培养室(32)、所述第三细胞培养室(33)的横截面形状为长方形，尺寸为:高1.5謹、宽1.5謹。4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述空气通道(11)的长度为1mm;所述液体通道(21)的长度为35mm ;所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)距离所述液体通道(21)的上游端的距离是2.2mm。5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一层液体入口(12)和所述第一层液体出口(13)的距离是15mm;所述第二层液体入口(22)和所述第二层液体出口(23)的距离是15mm。6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一连接通道(211)、所述第二连接通道(212)、所述第三连接通道(213)相互平行。7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一真空通道(14)与所述空气通道(11)的距离是2mm ;所述第二真空通道(15)与所述空气通道(11)的距离是2mm。
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于监测肿瘤转移过程的仿生微流控芯片。该微流控芯片由三层PDMS基片和两层多孔PDMS膜相互交错不可逆的封接而成。第一层PDMS基片上设有供空气流通的通道、供液体进出的入口和出口、真空通道的上半部分；第二层PDMS基片上设有供液体流通的通道、供液体进出的入口和出口、真空通道的上半部分；第三层PDMS基片上设有供细胞培养的细胞培养室；第一层PDMS基片上的通道位于第二层PDMS基片上通道的上游，第三层PDMS基片上的细胞培养室位于第二层PDMS基片上通道的下游。本实用新型的微流控芯片可用于体外检测肿瘤细胞转移的过程，为临床制定肿瘤治疗方案提供基础。
【IPC分类】C12M1/34, C12M3/00, C12M3/06
【公开号】CN204625653
【申请号】CN201520277074
【发明人】王琪, 高占成, 许志赟, 郭哲, 郝华龙, 徐一彤
【申请人】大连医科大学附属第二医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月30日