荧光纳米粒子Ru(bpy)₃/SiO₂、其制备方法及应用的制作方法

专利名称：荧光纳米粒子Ru(bpy)₃/SiO₂、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光纳米粒子Ru(bpy)3/Si02、其制备方法及应用。
背景技术：
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染所引起的一种严重的传染性疾病。在目前尚无 疫苗用于预防艾滋病的情况下，及时正确的诊断HIV感染是治疗和减少艾滋病传播的重要 手段。目前，普遍采用的艾滋病常规诊断方法是ELISA法，但ELISA法一般在96孔板上进 行，有着试剂消耗量大，检测成本高，检测时间长，检测灵敏度不够高且不能实现高通量化 的缺点，难以实现对大量群体的高通量、高灵敏、快速检测，如对疫情较严重地区人群的HIV 普查、监测，献血血源筛查等。蛋白质微阵列芯片技术是采用微阵列方法，对样品蛋白进行高通量、高灵敏、高特 异性的分析技术。Li QS等报导采用蛋白质微阵列芯片实行对HIV-1的早期诊断.Wu，JQ 等报导采用蛋白质微阵列芯片检测艾滋病的CD4+和CD8+T细胞的表面抗原。Burgess等 报导以Cy3作荧光标记物采用蛋白质微阵列同步检测HIV、HBV、HCV三种病毒。但以纳米 粒子作标记物应用于蛋白质微阵列芯片检测HIV尚未见文献报导。蛋白质微阵列芯片的检 测探针主要包括化学发光、酶、荧光等几种。其中以荧光物质作探针的优点是可重复检测、 可使用多种荧光物质进行多标记对多种分析物同时检测等。目前使用的荧光探针主要包括 普通有机荧光染料、稀土配合物及荧光纳米粒子等。相对于前两者，荧光纳米粒子的优势是 光稳定性好、荧光强度高、检测灵敏度高、生物相容性好等。因而，近年来将纳米粒子作为荧 光探针应用于蛋白质微阵列芯片等生物分析领域得到迅速发展和广泛应用。目前，可用作 探针的纳米粒子主要有贵金属纳米粒子、半导体量子点、及掺杂荧光分子的硅纳米颗粒等。 Petra Pavlickova利用纳米金制备了可检测血清免疫球蛋白抗体的蛋白质芯片。Jesse V. Jokerst等人利用CdSe/ZnS量子点作为蛋白质芯片上的荧光标记物成功检测了三种主 要的癌症指标蛋白CEA，CA125和Her-2/Neu。Zhang Heng等运用稀土配合物掺杂的二氧化 硅纳米颗粒对HBsAg进行时间分辨荧光免疫分析。Santra等人以荧光染料Ru(bpy)3与二 氧化硅复合的荧光纳米颗粒标记羊抗人IgG，用于识别人外周血SmlgG+B淋巴细胞，均获得 高的检测灵敏度。由于掺杂荧光分子的硅纳米颗粒的一个纳米颗粒中可包裹大量的荧光分 子，因而具有强的荧光强度与检测灵敏度，并且该类型纳米粒子还具有良好的水溶性、生物 相溶性、易于制备和表面易修饰等特点，因而成为目前研究的热点。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种荧光纳米粒子Ru (bpy) 3/Si02。本发明的目的之二在于提供该荧光粒子的制备方法。本发明的目的之三在于利用该荧光粒子在检测HIV p24抗原的应用—种荧光纳米粒子Ru (bpy) 3/Si02，其特征在于该荧光纳米粒子为核壳结构，核壳 结构以三联吡啶钌为内核，在三联吡啶钌的表面覆盖网状结构的二氧化硅，在二氧化桂表面带有活性氨基基团，其中三联吡啶钌与二氧化硅的质量比为1 180 1 190，且每毫 克纳米粒子含有70 80nmc)l氨基。上述的荧光纳米粒子为规则球形，平均粒径为64 76nm。一种制备上述的荧光纳米粒子Ru(bpy)3/Si02的方法，其特征在于该方法的具体 步骤为将环己烷、正己醇和Triton X-100按20 1 10 25 1 14的体积比混合 均勻后，加入水至溶液澄清透明，在再入Ru(bpy)jjC溶液，控制Triton X-100与Ru(bpy)3 的摩尔比为6340 1 6360 1 ；搅拌均勻后按10 1 5 10 1 7的摩尔比依 次加入正硅酸乙酯、3-氨丙基三甲氧基硅烷和氨水，并且正硅酸乙酯和Triton X-100的摩 尔比比为1 9 1 10;避光下搅拌反应22 26小时；加入丙酮破乳，超声分散，离心 分离，然后分别用无水乙醇和超纯水洗涤以除去表面活性剂及未反应的原料杂质，真空干 燥后，得到表面带有氨基的Ru(bpy)3/Si02荧光纳米粒子。一种上述的Ru(bpy)3/Si02荧光纳米粒子作为荧光探针在检测HIV p24抗原中的应用。所制备的核壳型染料掺杂的硅荧光纳米粒子Ru(bpy)3/Si02大小均一，单分散性 好，平均粒径为70士6nm ；且具有很好的光稳定性，用100W氙灯在最大发射波长照射90分 钟后其荧光强度只衰减了 8% ；在水溶液中不易发生染料泄露，连续超声1小时后泄露的染 料不到0. 05%。本发明首次将该荧光探针标记链酶亲和素后应用于蛋白质微阵列芯片检测 HIV p24抗原，采用的分析方法为夹心式荧光免疫分析法，结果显示荧光强度与p24浓度呈 良好的正相关性，分析灵敏度为3. Ing/mL。结果表明，该纳米粒子作为一种新型的荧光探针 可应用于高灵敏检测的蛋白质微阵列芯片及荧光免疫分析等系统。


图1为本发明的Ru(bpy)3/Si02纳米荧光颗粒的TEM图。图2 为 lmg/mLRu (bpy) 3 和 0. 5mg/mL 纳米荧光粒子 Ru (bpy) 3/Si02 的紫外-可见 吸收光谱。图3 为 lmg/mLRu (bpy) 3 和 0. 5mg/mL 纳米荧光粒子 Ru (bpy) 3/Si02 的 452nm 激发 的荧光光谱。图4为本发明的Ru(bpy)3/Si02纳米荧光粒子在水中的光漂白实验。图5为本发明的Ru(bpy)3/Si02纳米荧光粒子在水中的染料泄露实验。图6为本发明的Ru(bpy)3/Si02纳米荧光粒子标记SA后在452nm激发下的荧光光 谱，其中 Ru(bpy)3/Si02、Ru(bpy)3/Si02-BSA 及 Ru (bpy) 3/Si02-BSA_SA 的浓度分别为 0. 5、 0. 25、0. 25mg/mL)。图7为本发明的Ru(bpy)3/Si02纳米荧光粒子标记SA的原理示意8为芯片扫描图(第1 6点阵，p24抗原浓度分别为330，33，3. 3,0. 33,0. 033， Oy g/mL。每个点阵的固相抗体浓度从上至下分别为，0. 1，1，10，50，100,200,500u g/mL)。图9为微阵列蛋白质芯片的p24分析曲线(固相抗体、生物素-羊抗HIV p24多 克隆抗体及纳米粒子-链酶亲和素标记物浓度分别为100 u g/mL，0. 2mg/mL,0. 3mg/mL)。
具体实施例方式一、仪器与试剂Hitachi F-7000荧光分光光度计(日本日立公司)；Hitachi U-3010紫外-可见分光光度计(日本日立公司)；Hitachi CR22G/II高速离心机(日本日立 公司)JEOL 200CX透射电子显微镜(日本电子株式会社)。Genepix 4000B芯片扫描仪(美 国 Axon Instruments 公司)；QminiGrid 300 芯片点样仪(美国 Genomics Solution 公司)。三联吡啶钌(Rubpy) 3、3_氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、正硅酸乙酯(TE0S)、 TritonX-100等均为分析纯，购自SIGMA公司；正己醇、丙酮、氨水等均为分析纯，购自上海 豪申化学试剂有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、链酶亲和素(SA)等均购自北京欣京科生物 技术有限公司。HIV p24抗原，生物素-羊抗HIV p24多克隆抗体，购于美国Fitzgerald公 司，羊抗HIV p24单克隆抗体，购于北京博菲康生物技术有限公司。醛基玻片，购于上海百 傲科技有限公司。各种缓冲液为分析缓冲液(稀释缓冲液)0. lmol/1 PBS，0. 1%BSA,
0.Tween-20，pH7. 4。洗涤液0. 05mol/l PBS，0. 05% Tween-20，pH7. 4。封闭液0. lmol/ L PBS，pH7. 4,2% BSA,0. 01%叠氮钠。点样buffer 60% 0. 01mol/l PBS+40%甘油，pH7. 4。二、实验方法1. Ru (bpy) 3/Si02荧光纳米粒子的制备将7. 5. mL环己烷，1. 7mL正己醇，
1.8mLTriton X-100依次加入到圆底烧瓶中，搅拌20分钟使其混合均勻，再加入400 y L水， 继续搅拌至溶液澄清透明，加入100 U L 5mg/mL Ru (bpy) 3水溶液，搅拌5分钟后再依次加入 100uL TE0S和10 ii L APTMS, 10分钟后加入60 y L氨水，避光搅拌下反应24小时。反应完 成后加入适量丙酮破乳，超声分散，在12000转/分钟下离心分离，然后分别用无水乙醇和 超纯水洗三次以除去表面活性剂及未反应的原料等杂质，真空干燥后，得到表面带有氨基 的Ru(bpy)3/Si02纳米颗粒。图1为合成的核壳荧光纳米颗粒Ru(bpy)3/Si02的透射电子显 微镜图，由图1可以看出纳米粒子呈规则球状，大小比较均一，粒径为70 士 6nm，纳米微粒之 间没有相互粘连，单分散性很好。参见图2，Ru(bpy)3/Si02纳米粒子与Ru(bpy)3的吸收光谱图相似，它们的最大 吸收波长均为452nm，其中Ru (bpy) 3/Si02纳米粒子的最大吸收峰变缓是由于在纳米粒子 中Ru(bpy)3相对含量的降低造成的。参见图3，Ru(bpy)3/Si02纳米粒子最大发射波长为 590nm，与Ru(bpy)3的最大发射波(600歷)相比，其最大发射波长蓝移了约lOnm。这是由于 Ru(bpy)3的最大发射波长与其周围环境有较大关系，在水溶液中时，包裹后的Si02壳层阻 碍了 Ru(bpy)3与极性水分子之间的相互作用，从而使得最大发射波长发生蓝移。实验测得 lmg/mL纯Ru(bpy)3的荧光强度反而比0. 5mg/mL纳米颗粒低是由于高浓度的Ru(bpy)3发 生自身荧光淬灭所致。2.光漂白实验和染料泄露试验将浓度为lmg/mL的纯Ru(bpy)3染料和Ru (bpy) 3/Si02纳米粒子水溶液分别用 100W氙灯作为激发光源进行照射，样品距氙灯的距离为5cm，每隔15分钟测量一次最大发 射波长处的荧光强度，共测试90min，观测二种溶液的荧光强度随照射时间的变化。将制备好的纳米颗粒取lmg分散到4mL水中，测其荧光强度，测完后超声15分钟， 离心分离，弃去上清液，将沉淀下来的纳米颗粒又重新分散在4mL水中并测其荧光强度，然 后再超声15min，再离心分离并将沉淀重新溶于4mL水中测其荧光强度，重复上述步骤数 次，通过荧光强度的变化测量Ru(bpy)3/Si02纳米粒子在水溶液中超声不同时间后染料分子Ru(bpy)3&泄漏程度。参见图4，纯如0^7)3染料经过90min的氙灯照射后荧光强度衰减了 56%左右，而 Ru(bpy)3/Si02纳米粒子只衰减了约8%，表明其具有良好的抗光漂白的能力。参见图5，纳 米颗粒经过染料泄露实验后的荧光强度只减少了不到0. 05%，说明Ru(bpy)3/Si02纳米粒 子在水溶液中具有良好的稳定性，几乎没有发生染料泄露。3.纳米颗粒表面氨基定量实验利用氨基化合物与水合茚三酮反应生成蓝紫色物质在563nm处有明显吸收峰的 原理测定氨基。向2支5. 0ml离心管中分别加入5 ii L APTMSU. Omg Ru(bpy) 3/Si02纳米 颗粒，然后向每支离心管加入0. 5mL 0. 056mol/L的水合茚三酮溶液和1. 5mL水，最后向离 心管中分别加入0. lmL 0. lmol/L的NaOH溶液，80°C水浴加热5分钟，冷却后用U-3010紫 外_可见分光光度计测量其在563nm处的吸收。在测定Ru (bpy) 3/Si02纳米粒子的表面氨基数量时，以APTMS作为标准 物测量563nm处的吸光度做标准工作曲线，相关系数为0. 996，相关直线方程为y =-0. 00155x-0. 00362。然后将Ru (bpy) 3/Si02纳米粒子用同样的方法测定563nm处的吸 光度(假设纳米粒子内部的氨基不发生反应)，代入上述直线方程，即可算出纳米球表面氨 基的数量。结果为加入lOiUAPTMS的条件下所制备的直径为70nm左右的纳米球每毫克含 有约385nmol氨基。4纳米颗粒标记SA取lmg Ru (bpy) 3/Si02纳米颗粒，超声分散于0. lmol/L磷酸盐缓冲溶液中 (pH7. 2)，加入4. OmgBSA和0. 3mL 1 %的戊二醛水溶液，室温搅拌反应24小时，然后将纳米 颗粒离心、磷酸盐缓冲溶液充分洗涤以除去未反应的BSA分子等，再分散到lmL磷酸盐缓 冲溶液中，加入100 y g的SA和100 ii L 0. 1 %的戊二醛水溶液，室温下继续搅拌反应24小 时，加入0. 5mg的NaBH4，室温反应2小时。表面标有SA分子的纳米粒子经离心、洗涤后，以 pH8. 0的0. 05mol/LNH4HC03水溶液为洗脱液，用S印hadex G-50 (1. 0 X 30cm)柱进行进一步 分离纯化，将荧光强度高且在280nm处有最大吸收的组分收集在一起，最终得2mL纳米粒子 标记的SA溶液，加入1 % BSA后分装冰冻保存。Ru (bpy) 3/Si02纳米粒子标记SA的原理示意图，参见图7，将表面氨基化的纳米粒 子首先与BSA键合，然后再通过戊二醛将SA连接到BSA包裹的纳米微粒上。这样由于在SA 和纳米粒子之间存在柔韧性较好的BSA桥梁，使得标记SA的纳米粒子更容易与其它生物分 子反应，且保持SA的活性。用荧光分光光度计分别测量Ru(bpy)3/Si02纳米粒子、纳米粒 子-BSA结合体及纳米粒子-BSA-SA结合体的荧光光谱，结果参见图6所示，可以发现，它们 的发射光谱图相似，其最大发射波长都为590nm。5微阵列蛋白芯片检测HIV p24抗原将羊抗HIV p24单克隆抗体用分析缓冲液稀释成浓度系列0，0. 1，1，10，50，100， 200,500ug/mL,点样，8X8array，点间距300iim，共点6个微阵列点阵于同一片醛基玻片 片基上，4°C过夜。每点阵加40iiL封闭液4°C过夜，洗涤。往1 6点阵依次加入25 iiL不 同浓度p24抗原，p24抗原浓度系列为0,0. 033,0. 33，3. 3，33，330 y g/mL，37°C反应lh，洗 涤，各点阵分别加入25 ill 0. 2mg/mL生物素-羊抗HIV p24多克隆抗体，37°C反应1. 5h，洗 涤。往各点阵分别加入25 ii L 0. 3mg/mL纳米粒子-链酶亲和素标记物(NPs_SA)，室温反应lh，洗涤后于芯片扫描仪上测量。 在芯片测试实验中，根据条件实验的结果，当固定其它条件不变，改变生物素_羊 抗HIV p24多克隆抗体的浓度，分别进行荧光免疫分析测试，结果发现，测得的荧光强度值 随生物素-羊抗HIV p24多克隆抗体的浓度的增加而增加，但当其浓度达到一定值(0. 2mg/ mL)时，荧光信号不再随其浓度的增大而增大。固定其它条件不变，改变NPs-SA的浓度， 测得的荧光强度值随NPs-SA浓度的增加而增大，但当NPs-SA浓度达到0. 3mg/mL时，出现 平台。因此，我们选择生物素-羊抗HIV p24多克隆抗体及NPs-SA的浓度分别为0.2及 0.3mg/mL。芯片扫描结果如图8和图9所示。由图8、9可以看出，同一微阵列点阵，随着固 相抗体浓度的增加，荧光强度增大，不同微阵列点阵，固相抗体浓度相同情况下，荧光强度 随P24抗原浓度增大而增大，且荧光强度与p24浓度呈良好的正相关性。当固相抗体点样 浓度为100 u g/mL时，以本底信号(n = 10)标准偏差的3倍作为最低检测限计算此方法的 检测HIV p24抗原的最低检测限为3. Ing/mL。
权利要求
一种荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2，其特征在于该荧光纳米粒子为核壳结构，该核壳结构以三联吡啶钌为内核，在三联吡啶钌的表面覆盖网状结构的二氧化硅，在二氧化桂表面带有活性氨基基团，其中三联吡啶钌与二氧化硅的质量比为1∶180～1∶190，且每毫克纳米粒子含有70～80nmol氨基。
2.根据权利要求1所述的荧光纳米粒子Ru(bpy) 3/Si02,其特征在于该荧光纳米粒子为 规则球形，平均粒径为64 76nm。
3.一种制备根据权利要求1所述的荧光纳米粒子Ru(bpy)3/Si02的方法，其特征在于 该方法的具体步骤为将环己烷、正己醇和Triton X-100按20 1 10 25 1 14 的体积比混合均勻后，加入水至溶液澄清透明，在再入Ru (bpy) 3水溶液，控制Triton X-100 与Ru(bpy)3的摩尔比为6340 1 6360 1 ；搅拌均勻后按10 1 5 10 1 7 的摩尔比依次加入正硅酸乙酯、3-氨丙基三甲氧基硅烷和氨水，并且正硅酸乙酯和Triton X-100的摩尔比比为1 9 1 10;避光下搅拌反应22 26小时；加入丙酮破乳，超声 分散，离心分离，然后分别用无水乙醇和超纯水洗涤以除去表面活性剂及未反应的原料杂 质，真空干燥后，得到表面带有氨基的Ru(bpy)3/Si02荧光纳米粒子。
4.一种根据权利要求1所述的Ru(bpy)3/Si02荧光纳米粒子作为荧光探针在检测HIV P24抗原中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2、其制备方法及应用。该荧光纳米粒子为核壳结构，该核壳结构以三联吡啶钌为内核，在三联吡啶钌的表面覆盖网状结构的二氧化硅，在二氧化桂表面带有活性氨基基团，其中三联吡啶钌与二氧化硅的质量比为1∶5～1∶8，且每毫克纳米粒子含有约385nmol氨基。本发明的硅荧光纳米粒子Ru(bpy)3/SiO2大小均一，单分散性好，平均粒径为70±6nm；且具有很好的光稳定性，在水溶液中不易发生染料泄露。该荧光探针标记链酶亲和素后应用于蛋白质微阵列芯片检测HIV p24抗原，采用的分析方法为夹心式荧光免疫分析法，结果显示荧光强度与p24浓度呈良好的正相关性，分析灵敏度为3.1ng/mL。结果表明，该纳米粒子作为一种新型的荧光探针可应用于高灵敏检测的蛋白质微阵列芯片及荧光免疫分析等系统。
文档编号C09K11/06GK101864291SQ201010185659
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者刘斌虎, 尹东光, 张乐, 张礼, 谢春娟 申请人:上海大学