一种流式荧光微球标准物质及其制备方法与流程

本发明属于颗粒制备与应用
技术领域：
，涉及一种适用于流式细胞仪的荧光微球标准物质的制备方法。
背景技术：
：流式细胞术(Flowcytometry，简称FCM)是一种以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的现代细胞分析技术，可对单个细胞准确地定量分析和分类。流式细胞术在临床诊断和生物医学研究领域具有广泛应用，为了确保检测结果的准确性，流式细胞仪在使用前需要使用质控微球对仪器的荧光分辨率、灵敏度、光路及液流准直行、光电倍增管稳定性等进行校正，该质控微球即为荧光微球标准物质。目前我国流式细胞仪上使用的荧光微球全部依赖于进口，价格极其昂贵。国外的荧光微球标准物质通常是采用异硫氰酸荧光素(FITC)对微球进行标记。由于FITC对光、温度和pH都很敏感，容易发生荧光淬灭现象，稳定性差，使得FITC标记微球的制备工艺复杂，难以保证粒径的单分散性和荧光强度的均一性，并且在使用、存储和运输上要求苛刻。因此，寻找可替代的荧光染料并开发出一种适用于流式细胞仪且性能稳定的荧光微球具有重要的实用价值。技术实现要素：为了克服现有技术中的不足之处，本发明提供一种流式荧光微球标准物质及其制备方法。该方法制备的荧光微球标准物质粒径严格单分散，荧光强度均一，具有优异的稳定性。本发明采用的技术方案为：一种流式荧光微球标准物质的制备方法，包括以下步骤：(1)通过分散聚合法制得种子微球；(2)将所述种子微球分散到十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液中，将疏水性荧光染料溶于溶胀剂中，加入到种子微球的分散体系，经乳化、震揺、旋蒸，得到流式荧光微球标准物质。所述分散聚合法的步骤包括将乙醇、水、分散剂、引发剂、交联剂和单体混合均匀，然后在惰性气体保护下进行聚合反应，制得所述种子微球。所述乙醇、去离子水、分散剂、引发剂、交联剂和单体的用量比为：(90～150)mL：(5～12)mL：(1.8～2.2)g：(0.4～0.8)g：(0.05～0.12)g：(40～60)g。所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮，引发剂为偶氮二异丁腈，交联剂为二乙烯基苯，单体为苯乙烯。在步骤(2)中，所述乳化采用高剪切分散乳化机，转速为2000～5000r/min，时间为1～10min；震摇采用恒温摇床，转速为100～300r/min，4～8h；旋蒸采用旋转蒸发仪，在20～30℃下进行旋转蒸馏，时间为2～8h，压强为0.03～0.07MPa。所述乳化和震摇在常温下进行。在步骤(2)中，所述种子微球、十二烷基磺酸钠水溶液、疏水性荧光染料和溶胀剂的用量比为：(0.1～1.0)g：(10～100)mL：(1～1000)×10-5g：(1～10)mL，其中，在所述十二烷基磺酸钠水溶液中，十二烷基磺酸钠的浓度为0.1～1.0wt％。在步骤(2)中，所述疏水性荧光染料为苝系衍生物、香豆素类染料、油溶性量子点中的一种。所述苝系衍生物为苝四羧酸乙酯、苝四羧酸二酐、苝二甲酸二异丁酯、苝二酰亚胺中的一种。所述香豆素类染料为香豆素6、香豆素3-羧酸乙酯、4-羟基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素中的一种。所述油溶性量子点为ZnSe、CdSe、ZnS、ZnCdS中的一种。在步骤(2)中，所述溶胀剂为沸点低于60℃的溶胀剂，优选为二氯甲烷。本发明的目的还在于，提供一种上述方法制备的流式荧光微球标准物质。所述流式荧光微球标准物质为内部包覆有荧光分子的聚苯乙烯微球，粒径为3.0～3.5μm，变异系数为1％～4％，488nm光激发时的最大发射波长为520～540nm。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：(1)本发明采用两步法，先通过分散聚合法制备得到3.0～3.5μm、粒径严格单分散的种子微球，将疏水性荧光染料溶于溶胀剂中，再加入到种子微球的分散体系，然后通过乳化、震揺和旋蒸等联合处理步骤，将疏水性荧光染料溶胀进入种子微球内部，制得粒径严格单分散、荧光强度均一、具有优异稳定性的荧光微球标准物质。(2)本发明中溶胀过程采用种子微球的水相悬浮体系，同时将疏水性荧光染料溶于溶胀剂中，由于种子微球具有亲油疏水性，这便提供了荧光染料进入种子微球的驱动力。但由于溶胀剂为油相，与水相不相容，致使疏水性荧光染料无法进入种子微球。因此，本发明采用联合处理方法-乳化和震揺，不但可以使种子微球尽可能分散均匀，而且还可以提供强大的剪切力，将油相(溶有荧光染料的溶胀剂)打碎为极小的小油滴，增大其比表面积，使油、水两相充分接触，荧光染料均匀地进入种子微球，从而保证了制备的荧光微球荧光强度均一。(3)由于溶胀时种子微球会有不同程度的胀大，溶胀剂携带荧光分子向种子微球内部渗透，最终达到一种溶胀平衡状态(微球不再继续变大)，此时的微球与原来种子微球相比，变得软而大。本发明先通过乳化和震揺实现溶胀后的种子微球粒径均匀分布，而旋蒸可以将种子微球内部的溶胀剂全部蒸发走，荧光染料则被紧紧地包覆在种子微球内部，包覆了荧光染料的种子微球又重新恢复到原来种子微球大小(会略大一点，但差别极小)，从而重新呈现为粒径上的严格单分散。(4)本发明的溶胀剂采用沸点低于60℃的溶胀剂，尤其是二氯甲烷，旋蒸时很容易被完全蒸发走，避免旋蒸过程引起团聚；并且容易回收，可循环利用，减少污染。(5)本发明的荧光微球标准物质在488nm光激发时的最大发射波长为520～540nm，可适用于流式细胞仪的校准。(6)本发明的流式荧光微球标准物质具有优异的光、热、化学稳定性，其原因主要有以下3点：一、采用的荧光染料本身性质较为稳定；二、采用了疏水性荧光染料，制备的荧光微球标准物质分散于水相中，染料不易泄露；三、将荧光染料包覆在微球内部，而不是吸附或连接在微球表面上，近一步提高其稳定性。附图说明图1为实施例1流式荧光微球标准物质粒径的体积分布图。图2为实施例2流式荧光微球标准物质的荧光发射谱图，激发波长为488nm。图3为实施例3流式荧光微球标准物质的透射电子显微镜照片。图4为实施例4流式荧光微球标准物质的荧光发射谱图，激发波长为488nm。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。任何熟悉该领域的工程技术人员根据上述
发明内容对本发明所做的一些非本质的改进和调整，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。实施例1一种流式荧光微球标准物质的制备方法，包括以下步骤：(1)在三口烧瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮2.2g和乙醇140mL、去离子水9mL，一次性加入溶有偶氮二异丁腈0.76g和二乙烯基苯0.07g的苯乙烯55g，搅拌溶解均匀；通氮气保护，升温至69℃，反应22h；经离心洗涤和干燥，得到种子微球，其粒径为3.18μm，变异系数为2.14％。(2)称取种子微球0.4g加入到100mLSDS水溶液(质量分数为0.25％)中，超声分散，使种子微球分散均匀；将1.0mg苝四羧酸乙酯溶于5mL二氯甲烷中，加入到种子微球的分散体系；经乳化、震摇、旋蒸，离心洗涤，得到流式荧光微球标准物质。其中，乳化采用高剪切分散乳化机，温度为25℃，转速为3000r/min，时间为5min；震摇采用恒温摇床，温度为25℃，转速为120r/min，时间为6h；旋蒸采用旋转蒸发仪，在25℃下旋转减压蒸馏4h，压强为0.05MPa。上述流式荧光微球标准物质的粒径为3.22μm，变异系数为2.36％，单分散性良好。由图1粒径的体积分布图可知，其粒径呈正态分布，且分布很窄，表明荧光微球具有良好的单分散性。实施例2一种流式荧光微球标准物质的制备方法，包括以下步骤：(1)在三口烧瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮2.0g和乙醇120mL、去离子水7mL，一次性加入溶有偶氮二异丁腈0.53g和二乙烯基苯0.1g的苯乙烯50g，搅拌溶解均匀；通氮气保护，升温至70℃，反应20h；经离心洗涤和干燥，得到种子微球，其粒径为3.02μm，变异系数为1.78/％。(2)称取种子微球0.5g加入到50mLSDS水溶液(质量分数为0.25％)中，超声分散，使种子微球分散均匀；将0.2mg苝二甲酸二异丁酯溶于5mL二氯甲烷中，加入到种子微球的分散体系；经乳化、震摇、旋蒸，离心洗涤，得到流式荧光微球标准物质。其中，乳化采用高剪切分散乳化机，温度为25℃，转速为5000r/min，时间为2min；震摇采用恒温摇床，温度为25℃，转速为280r/min，时间为4h；旋蒸采用旋转蒸发仪，在20℃下旋转减压蒸馏8h，压强为0.03MPa。上述流式荧光微球标准物质的粒径为3.04μm，变异系数为1.92％，单分散性很好。由图2荧光发射谱图可知，其488nm光激发时的最大发射波长为532nm。实施例3一种流式荧光微球标准物质的制备方法，包括以下步骤：(1)在三口烧瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮1.8g和乙醇98mL、去离子水5mL，一次性加入溶有偶氮二异丁腈0.41g和二乙烯基苯0.05g的苯乙烯44g，搅拌溶解均匀；通氮气保护，升温至67℃，反应24h；经离心洗涤和干燥，得到种子微球，其粒径为3.36μm，变异系数为3.32％。(2)称取种子微球1.0g加入到100mLSDS水溶液(质量分数为0.25％)中，超声分散，使种子微球分散均匀；将5mg香豆素6溶于10mL二氯甲烷中，加入到种子微球的分散体系；经乳化、震摇、旋蒸，离心洗涤，得到流式荧光微球标准物质。其中，乳化采用高剪切分散乳化机，温度为25℃，转速为4000r/min，时间为7min；震摇采用恒温摇床，温度为25℃，转速为200r/min，时间为5h；旋蒸采用旋转蒸发仪，在30℃下旋转减压蒸馏8h，压强为007MPa。上述流式荧光微球标准物质的粒径为3.42μm，变异系数为3.38％，单分散性良好。图3透射电子显微镜照片表明，荧光微球的表面光滑，无破损，球形度高；微球之间没有粘连和团聚现象；微球排列整齐。实施例4一种流式荧光微球标准物质的制备方法，包括以下步骤：(1)在三口烧瓶中加入聚乙烯吡咯烷酮1.9g和乙醇130mL、水8mL，一次性加入溶有偶氮二异丁腈0.64g和二乙烯基苯0.06g的苯乙烯57g，搅拌溶解均匀；通氮气保护，升温至69℃，反应24h；经离心洗涤和干燥，得到种子微球，其粒径为3.17μm，变异系数为2.93％。(2)称取种子微球0.1g加入到15mLSDS水溶液(质量分数为0.25％)中，超声分散，使种子微球分散均匀；将10μgCdSe量子点溶于1mL二氯甲烷中，加入到种子微球的分散体系；经乳化、震摇、旋蒸，离心洗涤，得到流式荧光微球标准物质。其中，乳化采用高剪切分散乳化机，温度为25℃，转速为3000r/min，时间为8min；震摇采用恒温摇床，温度为25℃，转速为250r/min，时间为3h；旋蒸采用旋转蒸发仪，在25℃下旋转减压蒸馏8h，压强为0.05MPa。上述流式荧光微球标准物质的粒径为3.17μm，变异系数为2.94％，单分散性良好。由图4荧光发射谱图可知，其488nm光激发时的最大发射波长为525nm。对比例1流式荧光微球标准物质的制备方法基本与实施例1相同，不同点在于：不经过乳化、震摇、旋蒸的步骤，制备过程完成后，无法得到微球，得到的产品为完全粘连到一起、软而粘的不规则块状物，呈乳白色。无法得到微球的原因是：种子微球在SDS水溶液中不能均匀分散，与溶胀剂接触也不均匀，导致种子微球的溶胀程度不均匀，即有的粒径增加大，有的增加小，还有些与溶胀剂不接触的甚至不会发生溶胀，并且溶胀后的种子微球变软后完全粘连在一起，无法再分开。对比例2流式荧光微球标准物质的制备方法基本与实施例1相同，不同点在于：采用烘箱干燥代替旋蒸，在45℃下干燥4h，得到流式荧光微球标准物质。出现下列问题：(1)平均粒径增大；(2)单分散性变差；(3)荧光强度不均一；(4)溶胀剂不能回收。上述流式荧光微球标准物质的平均粒径为3.83μm，变异系数为12.54％，单分散性差。测试例室温、避光条件下，保存1、6、12个月后，使用荧光分光光度计测试并比较488nm光激发时，发射波长530nm的荧光响应值，每次测试均为随机取样。测试结果见表1，其中，第1、2、3、4组分别为实施例1～4的荧光微球标准物质，第5组为市售国外FITC标记荧光微球标准物质，第6、7组分别为对比例1和2的荧光微球标准物质，由于第6组产品为完全粘连，已经不能进行正常的测试。其测试所得的荧光响应值见表1。表1荧光强度的均一性和稳定性测试1组2组3组4组5组6组7组0月885.16292.562411.5693.661040.76-817.431月884.22292.142390.1793.631006.53-732.646月870.47288.632353.6692.54947.24-793.2912月851.26284.152298.4191.59859.15-424.81由表1数据表明：第1～4组荧光强度均一，且稳定性优异；第5组荧光强度均一，但稳定性较差；第7组荧光强度不均一，稳定性差。在保存12个月后，第1～5组的荧光衰减率分别为3.83％、2.87％、4.69％、2.21％、17.45％，与国外产品相比，本发明荧光微球标准物质具有优异的稳定性。其中，对比例2(第7组)的产品保存6个月比1个月的荧光强度要高、以及12个月后又大幅衰减(与实施例1相比)，这主要是由于制备的荧光微球标准物质的荧光强度不均一所致。当前第1页1 2 3