本发明属于生物医学材料制备领域，具体涉及一种金属纳米簇/mno2纳米片双模式探针及其制备方法和其在生物检测方面的应用。
背景技术：
现在的医疗诊断高度依赖于各种各样的检测成像技术，如荧光成像(fl)、超声成像(us)、核磁成像(mr)、计算机断层扫描(ct)、正电子发射计算机断层扫描(pet)、单光子发射断层扫描(spect)。然而，常规单一的成像检测模式很难为医护人员提供详细完善的病理信息来进行疾病的诊断和治疗。因此开发新型多模式纳米探针技术无论对分子成像还是疾病的诊疗都将起到积极的推动作用。
荧光纳米探针具有响应快速、分析灵敏和检测范围宽等优势，然而在实际应用中荧光纳米探针却仍然受限于其弱的组织穿透性以及低的空间分辨率。此时作为拥有高穿透性、高空间分辨率的核磁成像技术就恰好能完美地弥补荧光纳米探针的短板。因此，构建荧光/核磁双模式纳米探针具有重要的实际意义。例如将荧光/核磁双模式成像技术应用于临床诊疗过程中，就可以首先利用双模式纳米探针的核磁成像手段来进行病灶的准确空间定位，并提供更多详细的病理信息为医生对疾病的诊断以及制定后续治疗方案提供指导。在随后的治疗过程中则可以利用双模式纳米探针的荧光成像技术来实时清晰地显示病灶区域和边界，为医生进行手术操作提供精确的位置信息，从而有效降低医生的手术失误率，提高患者的手术成功率。
mno2纳米片拥有巨大的表面积和强的光吸收能力，能同时作为载体和淬灭剂用于负载和淬灭荧光基团。然而常规mno2基复合纳米材料仍然是通过后组装的策略来制备。即先分步制备荧光基团与二维mno2纳米片，再通过非特异性结合来将二者进行组装。而非特异性的后组装策略往往会带来稳定性差的缺陷。此外，在常规二维mno2纳米片的制备过程中不可避免地需要使用强氧化性的试剂(高锰酸钾)、有毒的表面活性剂以及有机溶剂等。这些强氧化性、有毒有害试剂的使用严重限制了复合纳米探针在实际生物样本检测中的应用。
技术实现要素：
本发明第一目的在于，提供一种金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料(本发明也简称为复合纳米材料)。
本发明第二目的在于，提供一种所述的金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料的制备方法；旨在提供一种一锅反应方法，制得原位复合的材料。
本发明第三目的在于，提供了所述的金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料的应用，旨在实现荧光-核磁双模检测。
一种金属纳米簇/二氧化锰纳米片复合纳米探针，包括二氧化锰纳米片，以及原位生长在其表面的金属纳米簇。
本发明提供了一种复合纳米探针，金属纳米簇直接复合在二氧化锰纳米片的表面，金属纳米簇直接复合在二氧化锰纳米片之间实现了原子层面的接触。相对于金属纳米簇、二氧化锰纳米片二者物理混合的物料或通过修饰基团将二者连接的物料；将金属纳米簇直接生长在二氧化锰纳米片的表面，通过所述的原位生长复合，可明显提升二者的协同效果，明显提升材料的性能以及稳定性，并能够带来新的技术效果。
本发明所述的金属纳米团簇为由几个到一百多个金属原子构成的金属原子团簇，作为优选，所述的金属纳米簇为具有荧光性质的纳米簇。
作为优选，所述的金属纳米簇的金属原子为au、ag、cu中的至少一种。
优选地，金属纳米簇的粒径为0.5～2.5nm；进一步优选1～2nm。
优选地，二氧化锰纳米片的厚度为0.5～2.5nm；进一步优选0.5～1.5nm。
优选地，二氧化锰纳米片和金属纳米簇的摩尔比为0.5～2∶1；进一步优选为1～2∶1。
本发明还公开了一种所述的金属纳米簇/二氧化锰纳米片复合纳米探针的制备方法，将包含将mno2前驱体、金属纳米团簇前驱体、蛋白质、碱的溶液在25～50℃下一锅反应，即得金属纳米簇/二氧化锰纳米片复合纳米探针。
为解决现有荧光纳米探针检测模式单一、制备工艺复杂、制备过程中需使用有毒有害、强氧化性的原料、表面活性剂和有机溶剂等问题。本发明通过蛋白矿化策略，以蛋白质为模板，在碱性条件下经一步反应过程制备金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米探针的简易方法。本方法旨在改善传统mno2基荧光纳米探针单一的检测模式并极大简化合成工艺。通过本发明方法制备的复合体系在h2o2的双模式分析检测上展现出了优秀的效果。
本发明中充分利用蛋白质在碱性条件能分别作为模板进行金属纳米团簇和二维mn02合成的特点，通过向反应体系中同时引入mn源与金属源即可在温和条件下实现金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料的一步制备，大大简化了常规mno2基复合纳米材料繁琐的制备工艺。本方法制备的金属纳米簇原位生长在mno2纳米片，相较于现有物理混合方式或者键合修饰方法(非特异的制备方法)，可出人意料地提升荧光检测性能，还能协同获得核磁方面良好的性能，有效结合了金属纳米簇的荧光检测模式与mno2纳米片的核磁检测模式，使得该复合纳米探针拥有对h2o2的双模式响应，并可协同提升双重模式检测的性能。此外，由于蛋白质分子的残留也使得本方法制备的金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料拥有高的生物相容性，使得其在血清样本以及胞内h2o2检测上也表现出不错的效果。
本发明选用蛋白质作为模板剂，在碱性条件下通过一步矿化的形式来组装金属纳米簇/二维mno2纳米复合结构。本发明方法：首先，向蛋白质水溶液中分别加入mno2前驱体和金属纳米团簇前驱体，随后向上述溶液中加入一定浓度的碱溶液来调整溶液ph值，并于所述的温度下反应一定时间，最后经透析出除未完全反应的离子即可获得金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料。
一锅同步合成该复合材料时，相对于仅合成一种物料，需要克服诸多技术问题，例如，难于同步、一锅制得二氧化锰纳米片和具有荧光性能的纳米团簇；此外，还需要解决得到的材料，用于检测过程中，灵敏度不高的技术问题。为了解决这些技术问题，本发明人通过大量研究发现，对二氧化锰纳米片前驱体、金属纳米簇的质量比控制在合适的范围内，可避免在二氧化锰上形成金属颗粒，利于形成具有荧光性能的纳米团簇；此外，还有助于得到在h2o2检测方面具有良好灵敏性能的复合材料。研究还表面，在一锅制备过程中，除控制两种前驱体之间的比例外，对一锅反应过程中的反应温度、反应时间等参数进行核实调控，可进一步提升得到的复合纳米探针的性能。
作为优选，所述的mno2前驱体、所述的金属纳米团簇前驱体的摩尔比为0.5～2∶1。所述的mno2前驱体、的摩尔比优选为两种前驱体中，金属元素之间的摩尔比。
研究表面，将mno2前驱体、所述的金属纳米团簇前驱体的摩尔比控制在该优选范围下，有助于通过一锅反应下，形成二氧化锰纳米片以及在其表面原位生长具有荧光性能的金属纳米团簇。只有在特定的范围内才能得到相应的复合物，所述的金属纳米团簇前驱体投加量超出所述的范围，难于一锅原位生成带荧光的金纳米团簇，而是生长成为没有荧光性质的金纳米颗粒；如果锰过量，在检测h2o2时就会造成检测灵敏度低。
作为优选，所述的mno2前驱体、所述的金属纳米团簇前驱体的摩尔比为1～2∶1。
发明人发现，在一锅制得金属纳米簇和二氧化锰纳米片时，除控制前驱体的比例外，控制反应的蛋白质的浓度、反应温度，可利于进一步得到在二氧化锰纳米片上原位均匀生长金属纳米簇的复合材料。
作为优选，所采用的单位可以为单一蛋白，或者混合蛋白。
所述的混合蛋白可以为优选的单一蛋白的组合，或者鸡蛋清。
作为优选，所述的蛋白质模板剂为某单一组分蛋白如牛血清白蛋白、人血清蛋白、丝蛋白、溶菌酶；或混合蛋白如鸡蛋清。
进一步优选，所述的蛋白质选自牛血清白蛋白、人血清蛋白中的至少一种。
本发明人还发现，通过调控蛋白质浓度，可实现对mno2纳米结构的调控。
作为优选，所述的蛋白质溶液浓度(一锅反应的起始溶液)为10～60mg/ml。本发明人发现，在所述的蛋白质浓度下，有利于一锅同步得到金属纳米簇/二维mno2纳米复合结构。
在该优选的蛋白浓度下，有助于一锅制得所述的二氧化锰纳米片，且有助于金属纳米簇的原位生长。在没有蛋白或蛋白浓度过低时是不会生成mno2纳米片的，当蛋白浓度过高超过60mg/ml时反应液会形成凝胶固体也得不到相应产物。
进一步优选，起始溶液中蛋白质浓度为20～40mg/ml。
作为优选，所述反应温度为25～50℃。本发明人发现，温度会影响一锅制备所述的复合材料的成功率；例如，反应温度过低(例如低于25℃)，会导致反应速率较慢甚至不发生反应，而反应温度过高(例如50℃)，则会导致蛋白质的严重变性影响复合物的形成。
进一步优选，所述反应温度为30～40℃。
所述的荧光金属纳米簇前驱体为金属纳米簇的金属原子对应阳离子的盐。
所述金属纳米簇前驱体选自为aucl4-、ag+、cu2+中至少一种的盐。
更进一步优选，所述金属纳米簇前驱体选自haucl4、agcl、agno3、cucl2、cu(no3)2、cuso4中的至少一种。
本发明所述的mno2前驱体为含mn的物质，作为优选，所述含mn物质为mn2+的无机盐类。
例如，所述的mn无机盐选自mn(no3)2、mncl2、mnso4、mn(ch3coo)2中的至少一种。
进一步优选，所述的碱性化合物选自mn(no3)2、mncl2中的至少一种。
本发明所述的碱优选为碱金属氢氧化物。
例如，所述的碱选自lioh、naoh、koh、ruoh、csoh中的至少一种。
进一步优选，所述的碱性化合物选自naoh、koh中的至少一种。
作为优选，所述的一锅反应的起始溶液的ph值为7～14。
本发明人发现，在所述的ph值范围内，有利于一锅合成金属纳米簇/二维mno2纳米复合结构的制备。
进一步优选，所述的ph值为11～13。
作为优选，所述的反应时间为0.5～72小时。本发明人发现，反应时间若超出上述范围，对产物组成、形貌及性能会产生不良影响。
进一步优选，所述的反应时间为6～14小时。
本发明所述的制备方法，作为优选，一锅反应后，再经透析出除未完全反应的离子即可获得金属纳米簇/mno2纳米片复合纳米材料。
本发明所优选的制备方法，通过透析方法，脱除其中的离子，还保留蛋白以及所述的复合材料，如此可进一步提升生物适应性，提升检测效果。
作为优选，透析过程采用的透析介质的截留分子量为3.5～14kda。
本发明还包括采用所述方法制得的金属纳米簇/二维mno2纳米复合材料。该材料中的金属纳米簇直接原位复合在二维mno2纳米片的表面，不同于通过基团连接修饰材料，可出人意料地实现金属纳米簇、mno2纳米片之间的协同性，提升复合材料的性能，且首次实现了双模条件下检测h2o2。
一种所述的金属纳米簇/二氧化锰纳米片复合纳米探针的应用，用于h2o2的检测。
本发明首次提出采用所述的原位复合的材料在荧光和核磁的双模式下检测h2o2。此外，本发明人还发现，通过所述一锅原位生长的材料之间的协同，可提升h2o2检测中的应用效果，例如，明显改善检测灵敏性、准确性。
优选地，在荧光检测模式和/或核磁检测模式的双重模式下，检测h2o2。
本发明相比于现有技术有以下优点：
1、合成简单。本方法采用以蛋白质为模板剂，在碱性条件下通过一步矿化的方式实现了荧光金属纳米团簇与二维mno2纳米片的有效复合。本方法在极大地简化传统复合荧光纳米探针制备步骤繁琐的同时也避免了传统制备方法需要使用强氧化性、有毒有害的表面活性剂或有机溶剂的缺点。另外，本方法反应条件温和，无需高温高压操作，便于进行大规模放大制备。
2、荧光/核磁双模式检测，改善了传统mno2基荧光纳米探针检测模式单一的不足。双模式检测将在实际临床应用中展现出优势，高穿透性、高空间分辨率的核磁成像模式可在术前为手术方案的制定提供详细、精确的诊断信息，而荧光成像模式可在治疗过程中直观地为医护人员提供准确的病灶位置信息。
3、生物相容性好。本方法制备的复合纳米材料由于表面残留有蛋白质分子，使得其生物相容性好、毒性低、可被细胞大量摄入。本发明所制备的这一特点也为本方法制备的复合纳米材料在生物学上的实际应用提供了保证。
附图说明
【图1】实施例1制得的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物的相关表征：tem(a、b)，hrtem(c)，afm(d)，xrd(e)以及xps(fg)；
【图2】实施例1制得的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物用于h2o2荧光模式检测；
【图3】实施例1制得的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物用于h2o2核磁模式检测；
【图4】au纳米团簇对h2o2的响应；
【图5】mno2纳米片对h2o2的紫外可见光谱信号响应；
【图6】mno2纳米片对h2o2的核磁信号响应；
【图7】实施例4得到的复合材料的tem图；
【图8】实施例5得到的复合材料的tem图；
【图9】对比例1得到的材料的tem图；
【图10】对比例2得到的材料的tem图；
【图11】对比例3得到的材料的tem图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1
au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物的制备以及用于h2o2荧光/核磁双模式检测
首先，将100μl的bsa(牛血清蛋白)溶液(250mg/ml)与450μl二次水混合均匀，然后向上述溶液中分别依次加入200μlmn(no3)2溶液(50mm)以及200μlhaucl4溶液(25mm)，待搅拌均匀后再加入50μlnaoh溶液(5m)，随后反应在磁力搅拌下于37℃反应12小时。反应结束后自然冷却至室温，并将反应液用截留分子量为14kda的透析袋进行透析，以除去未完全反应的金属盐与naoh，最终所得产物于4℃下保存。
由图1可知，本实施例所得复合物形貌为二维片状结构(低倍tem，afm)，mno2纳米片上均匀地负载有平均粒径约为1.91nm的au纳米团簇。hrtem显示了典型的mno2晶格特点，haadf元素分布图显示产物中均匀地分布着mn、o、au、n、s元素，xrd表征表明复合产物中以mno2晶相为主，xps表征展示了典型的mno2以及au纳米团簇的特征峰。综上可知本方案制备的复合物为au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物。
荧光模式检测，用ph为7.0的pbs缓冲液配制浓度为100μm的h2o2母液，并于4℃储存。后续测试中所用不同浓度的h2o2溶液均由此母液进行逐级稀释得到。将au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物用pbs溶液进行稀释，随后将其均分为多份，每份400μl，其中含有625μm的au纳米团簇/mno2纳米片。向上述au纳米团簇/mno2纳米片pbs溶液中加入不同浓度的h2o2溶液，并于室温下孵化30分钟。之后在470nm的激发下测量溶液在500-800nm范围的荧光强度。
由图2可知，本发明所制备的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物对h2o2有灵敏的荧光响应，其在0.06-2μm范围内具有良好的相关性，且其检测限达到了53nm。
核磁模式检测，将au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物用pbs溶液进行稀释，配制成浓度为2mm的母液。随后将上述母液逐级稀释为不同浓度的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物pbs溶液。将400μl含有不同浓度au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物的pbs溶液与另外100μl含有1mmh2o2的pbs溶液混合，并于室温下孵化30分钟后进行核磁成像测试。
由图3可知，本发明所制备的au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物对h2o2有灵敏的核磁信号响应。其在0.01to0.2mm范围内具有良好的相关性。
实施例2
单一au纳米团簇的制备及其对h2o2的荧光响应
首先，将100μl的bsa溶液(250mg/ml)与650μl二次水混合均匀，然后向上述溶液中加入200μlhaucl4溶液(25mm)，待搅拌均匀后再加入50μlnaoh溶液(5m)，随后反应在磁力搅拌下于37℃反应12小时。反应结束后自然冷却至室温，并将反应液用截留分子量为14kda的透析袋进行透析，以除去未完全反应的金属盐与naoh，最终所得产物于4℃下保存。
由图4可知，单独的au纳米团簇对0-20μm的h2o2几乎没有响应。当h2o2浓度高于20μmau纳米团簇的荧光响应信号与h2o2浓度也没有呈现出线性关系。此实施例证明单一的au纳米团簇在h2o2检测上没有实际应用前景。
实施例3
单一mno2纳米片的制备及其对h2o2的紫外与核磁响应
首先，将100μl的bsa溶液(250mg/ml)与650μl二次水混合均匀，然后向上述溶液中加入200μlmn(no3)2溶液(50mm)，待搅拌均匀后再加入50μlnaoh溶液(5m)，随后反应在磁力搅拌下于37℃反应12小时。反应结束后自然冷却至室温，并将反应液用截留分子量为14kda的透析袋进行透析，以除去未完全反应的金属盐与naoh，最终所得产物于4℃下保存。
由图5可知，单独的mno2纳米片对h2o2同样表现出较为灵敏的响应。并且紫外变化与h2o2浓度存在线性关系。然而，单独的mno2纳米片对h2o2的检测限要远高于au纳米簇/mno2二维纳米片复合物。造成这一结果的原因主要为紫外检测的灵敏度要远低于荧光检测。因此，利用单独的mno2纳米片对h2o2进行光谱学检测不具有实际应用意义。
由图6可知，单独的mno2纳米片对h2o2的核磁成像效果表现出了与au纳米团簇/mno2二维纳米片复合物近似的效果，说明复合物的核磁成像归功于mno2纳米片，au纳米团簇不会影响mno2纳米片的核磁性能，还具有一定的提升效果。
实施例4
和实施例1相比，区别仅在于，反应温度为30℃；得到的材料tem见图7，从产物的tem表征上可以看到当反应温度控制在30℃时仍然能得到形貌均一的au纳米团簇/mno2复合物。
实施例5
和实施例1相比，区别仅在于，锰/金摩尔比1∶1；此时锰金摩尔比仍在本发明权利保护范围内，得到的材料tem见图8，从产物的tem表征上可以看到当锰金摩尔比为1∶1时仍然能得到形貌均一的au纳米团簇/mno2复合物。
对比例1
和实施例1相比，区别仅在于，温度分别20℃和60℃。得到的材料tem见图9(左图为20℃)；没有得到所要求的材料，当温度低于25度或高于50度时均难以得到二维的mno2纳米片。温度低于25度时产物为大的块体和团聚体形貌，当高于50度时产物中将出现大量小纳米颗粒。
对比例2
和实施例1相比，区别仅在于，蛋白浓度为5mg/ml。得到的材料tem见图10；没有得到所要求的材料，当蛋白浓度过低时所得复合物形貌不均一，样品以大的纳米颗粒为主夹杂少量纳米片。
对比例3
和实施例1相比，区别仅在于，锰金摩尔比小于0.5∶1(具体为0.3∶1)。得到的材料tem见图11；没有得到所要求的材料，当锰金摩尔比小于0.5∶1时金元素以没有荧光的金纳米颗粒的形式存在而不再生成au纳米团簇，此时得到的产物为mno2纳米片包裹的金纳米颗粒。
基于上述实施例和对比例，本发明技术方案至少具有以下优势：
1，材料制备上的优势。采用物理混合以及基团修饰连接的制备方法需要多步反应过程，即先分开制备荧光基团与mno2纳米片，再通过一定手段将二者复合。而本发明的方法只需进行一步操作，通过控制前驱体的比例、反应温度和蛋白质浓度，克服一锅反应存在的难于原位生长得到复合材料，且检测灵敏度不高的技术问题，进而获得一步原位生长、且具有良好灵敏度、具有双重检测模式的复合材料。本发明制备方法简便，免去繁琐的制备过程。
2，材料稳定性。采用物理混合以及基团修饰连接的方法制备复合材料往往利用的是材料间的静电吸引力、物理交联、物理或化学吸附等作用来实现复合，然而受材料所处环境的变化或材料带电性质的变化等外界因素的影响，复合材料间的这些弱作用并不能保持复合材料长时间的稳定性。而本发明提供的合成方法则是直接在金属纳米簇与mno2纳米片各自原位成核生长，二者直接接触、有效复合，二者牢牢地连接在了一起，表现出了较好的稳定性。
3，独创的应用。本发明独创性地提供一种具备荧光和核磁双模检测的创新性检测思路，并通过研究，通过了一种可实现所述的检测思路的复合材料；通过所述的直接原位复合的这一独特结构的材料的使用，可以实现荧光和核磁的双模检测，并且通过二者的直接原位复合，使两者相互协同，明显提升荧光的检测灵敏度，此外，还有助于提升核磁检测性能。
4，生物安全性。纳米探针在生物医学上的应用要求其具有高的生物安全性，而采用物理混合以及基团修饰连接等分步制备纳米探针的方式往往存在在制备过程中使用强氧化性、有毒有害的表面活性剂、有机溶剂等危害材料后期应用的试剂。而本发明提供的制备方法不涉及到以上任何一种有害试剂的使用，且产物表面残留的蛋白还会进一步提升复合材料的生物相容性，为材料的后期生物医学应用奠定了基础。