不同烷基链长的双核钌配合物作为细胞中的溶酶体探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本专利属于荧光生物分子探针领域，涉及双核钌配合物在靶向检测癌细胞溶酶体 细胞器荧光探针等相关领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 溶酶体是真核细胞内的一种酸性细胞器，负责细胞的消化、降解功能，溶酶体在 细胞各种生命活动，包括物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡中发挥着重要作用（P. Saftig， J. Kl μ mperman，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009,10,623-635 ;G. Kroemer，Μ· Jaattela，Nat. Rev. Cancer 2005,5,886-897 ;M. E. G μ icciardi，M. Leist，G.J. Gores，0ncogene2004， 23,2881-2890)。如果它发生功能紊乱，会引发诸如肿瘤、炎症、矽肺等多种疾病的产生 (Fehrenbacher，N. Jaattela，ECancer Res. 2005,65, 2993-2995)。溶酶体荧光探针能 够实现对溶酶体的标记，标记溶酶体位置，直观地监测溶酶体在生理、病理过程中的动态 变化，对于深入地理解溶酶体参与生命活动的分子机制，而且对疾病的治疗具有重要的指 导意义。因此，研究、开发溶酶体荧光探针具有重要的理论意义及实际应用价值。本文中 共提及三个双核钌配合物可用作溶酶体荧光探针，其中配合物Ru2已经报道于文献（Liu， P. ；Liu, J. ；Zhang, Y. -Q. ；ffu, B. -Y. ；ffang, K. -Z. J. Photochem. Photobiol. B. 2015,143, 89-99)，但只讨论了其细胞吸收的性质并没有研究其在细胞中的具体定位，本发明应用了 细胞核、线粒体、溶酶体三种染料和三个配合物进行共同染色，在共聚焦显微镜下观察到了 三个不同烷基链长的双核钌配合物定位于细胞中的溶酶体。目前具有溶酶体定位能力的双 核钌配合物荧光探针还未见报道，该研究为开发双核钌配合物类溶酶体荧光探针提供了有 意义的探索。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是制备三种不同长度烷基链的双核钌配合物，应用了 MTT法（3_(4， 5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法）和高内涵分析法探究了三个配合物 对细胞的毒性，并通过荧光共聚焦方法对三种配合物进行了共定位成像研究，以Hoechst 33342 (三氯化氢2-(4-乙基苯基）-5-(4-甲基-1-哌嗪基）-2, 5-二-IH-苯并咪唑）、 Mitotracker green、LysoTracker green三种焚光探针为标准物，经过共定位分析，证实三 种配合物在癌细胞中能实现对溶酶体的标记。
[0004] 本发明的技术方案如下：
[0005] 本发明采用的三种双核钌配合物的配体用LI，L2, L3表示，三种配合物用Rul， Ru2, Ru3,代表，结构如下：
[0006] 上述双核钌配合物的合成途径如下所示：
[0007]
[0008] η = 10, [ (bpy) 2Ru (L1) Ru (bpy) 2] (ClO4)4 Rul
[0009] η = 6，[ (bpy) 2Ru (L2) Ru (bpy) 2] (ClO4) 4 Ru2
[0010] η = 3，[ (bpy) 2Ru (L3) Ru (bpy) 2] (ClO4) 4 Ru3 toon] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0012]目前已经发现的大多数探针缺乏特异的靶向性，且不能提供客体分布的定量信 息。迫切需要开发出具有细胞器定位功能以及能够反映客体分布的荧光探针本发明合成的 三种配合物与活细胞共同培养即可进入活细胞内，进而特异性地进入细胞内的溶酶体这 一细胞器，导致溶酶体的的荧光强度显著增强，进而用于癌细胞内溶酶体生理活动的监测。 同时钌配合物相比于传统溶酶体荧光探针还具有光化学性质稳定、消光系数大、荧光寿命 长和斯托克位移大等特点。且本发明第一次使用了高内涵分析的方法来检测配合物药物的 细胞毒性，高内涵提供了一种灵敏度高、操作简便、使用安全的细胞增殖与活性检测方法， 与传统的MTT实验相比具有明显的优势。
【附图说明】
[0013] 图I HeLa细胞在不同浓度的配合物Rul_Ru3孵育48h后的细胞活性图
[0014] 图2 HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小时后，用Hoechst 33342染色30分钟后共聚焦图片
[0015] 图3 HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Rul-Ru3孵育24小时后，在 Mitotracker green染色30分钟后共聚焦图片
[0016] 图4 HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小时后，在 Lysotracker green染色30分钟后共聚焦图片
[0017] 图5 HeLa细胞在浓度为50微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小时后的细胞周期分 布图
[0018] 图6 HeLa细胞在浓度为50微摩的配合物Rul_Ru3孵育24小时后的细胞凋亡百 分比图
[0019] 图7 HeLa细胞在浓度为10微摩和40微摩的配合物Rul和Ru3孵育24小时后 的细胞周期分布和凋亡百分比图
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 :配体LU L2、L3和三个钌配合物的制备
[0021] 1.前体的制备：1，3_二-(4-醛基-咔唑基）丙烷、1，6_二-(4-醛基-咔唑基） 己烷、1，10-二-(4-醛基-咔唑基）癸烷的合成参照文献（张玉琦，北京师范大学硕士学位 论文；Zhang，Y. ；ffada, T. and Sasabe, H. Jo μ rnal of Polymer Science ：Part A ：Polymer Chemistry. 1996,34, 2289-2298 ;0stra μ skaite，J. ;Voska，V.and Graz μlevici μ s， J. V. MonatsheftefiirChemie. 2002,133, 599-607.)中方法合成。
[0022] 2. 1，10-邻菲罗啉-5,6_二酮的合成：综合了多种文献方法的优点，（Amouyal， E. ；Homsi, A. ；Chambron, J. -C. and Sauvage, J. -P. J. Chem. Soc. , Dalton Trans. 1990， 1841-1845 ；Hiort, C. ；Lincoln, P. and Norden, B.J. Am. Chem. Soc. 1993,115,3448-3454 ； Paw, ff. and Eisenberg, R. Inorg. Chem. 1997,36, 2287-2293. ；Calderazzo, F. ；Marchetti, F. ;Pampaloni，G. and Passarelli，V.J. Chem. Soc.，Dalton Trans. 1999,43894396)实验 之前应将一水合邻菲罗啉（10克，50毫摩）和溴化钾（10克，84毫摩）用研钵研细后到入 一个装有磁子的三口瓶中，封好口后放入冰箱冻一夜，另外，要将浓硫酸（100毫升）和浓硝 酸（50毫升）事先混匀，也放入冰箱中冻一夜。实验时，先将三口瓶放入冰盐浴中冻一段时 间，装上冷凝管，在缓慢地沿着瓶壁加入冻好的混合酸。刚加入酸时，可以看见有少量的溴 生成，当固体被酸浸没后，产生溴的速度减慢。加完酸后，将冰浴撤去，让反应体系恢复到室 温，待固体完全被酸浸透后，开始用磁子搅拌，可见有部分溴生成。缓慢地加热至85°C左右 反应8小时，反应时可见有大量的溴回流，溶液呈红色透明状。8小时后，撤去冷凝管，拔掉 瓶塞，油浴温度维持在85°C左右，除去溴，约需一夜时间。停止加热后，趁热将橙黄色溶液 到入1200毫升碎冰中，溶液呈黄绿色。用碳酸氢钠将溶液中和至pH = 5~6,如果水加得 合适，到预期的PH值时，会出现大量的黄色沉淀（水少时，将出现大量的盐，造成萃取困难； 水多时，虽然沉淀被溶解，但是仍然可用二氯甲烷萃取出产品）。用二氯甲烷反复萃取直至 水层呈淡粉色。用少量水洗去有机层中残留的少量溴，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤后， 再将二氯甲烷蒸干。粗产品用大约800毫升无水甲醇重结晶。重结晶溶液较稀时经过缓慢 冷却，可以得到较大的黄色针状晶体，过滤收集产品后，滤液大约浓缩一半，经过缓慢冷却 后又析出第二份产品，滤液继续浓缩还可以析出产品。前两次析出产品的产率可达50%以 上。真空干燥，得黄色固体。
[0023] 3. Ll 的合成：参照文献合成方法（Liu，P.