一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法
【专利摘要】本发明属于功能性生物纳米材料技术领域，具体涉及一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法，在水热法制备过程中采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂修饰，通过设计多肽序列保证金属团簇的稳定性制备对细胞核仁具有靶向标记作用的红色荧光金纳米簇，其粒径为1.5?2.8nm范围内，平均颗粒直径为1.9nm，金纳米簇在400nm附近有明显的吸收峰，当用400nm的激发光对金纳米簇照射时，在500?750nm区间有较强的荧光发射，发射峰在586nm附近，金纳米簇的荧光量子产率为7％。该方法简单，操作性强，成本低，材料表面用多肽稳定，生物亲和性好，采用多肽多为稳定剂毒性低，稳定性好，发射波长，利于得到更好的核仁成像效果。
【专利说明】
一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法
技术领域
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[0001]本发明属于功能性生物纳米材料技术领域，具体涉及一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂修饰，通过设计多肽序列保证金属团簇的稳定性制备对细胞核仁具有靶向标记作用的红色荧光金纳米簇。
【背景技术】
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[0002]细胞核仁是细胞核内的重要亚核结构，对于细胞的生长、增殖都有重要作用。除此之外，核仁还是细胞核内rRNA转录、翻译以及核糖体组装的场所，因此又被称为“核糖体工厂”，甚至有文献报道核仁也是某些病毒的靶向攻击位置。细胞核仁并不是一直存在的，它形成于细胞分裂间期，由熔融态的核仁物质聚集形成，目前对于细胞核仁的生物学作用的研究尚不成熟。研究核仁及其相关过程时，非常重要的步骤是对核仁进行标记将核仁可视化。目前，对于核仁的可视化方法，得到普遍认同的有①银染法一通过AgNO3与细胞核仁处的酸性蛋白反应，实现银的还原，生成黑色银颗粒，进而对核仁位置进行标记，缺点是在光学显微镜下呈黑色且无荧光信号，不利于进一步的研究使用；②商业化的STYO染料染色法一在480nm激发下有500nm的荧光发射，并且染料分子与RNA结合后荧光强度会存在数量级的变化，但染料分子的结构没有公开报道。
[0003]近年来，随着研究的不断深入，对核仁特异性染色的其他材料也相应进入人们的视线，如以稀土元素铕为配位中心构成的稀土配合物；以吡啶，吡咯及苯等芳环结构构成的超低分子量的荧光探针；以及由过渡金属元素锇、铱组成的异核双配位化合物均可对细胞核仁进行特异性的标记。这类材料的共同特征就是表面含有大量的芳环结构，可能是对核仁进行靶向识别的作用基团。越来越多的荧光纳米材料应用于荧光标记领域，与传统的化学染料相比，荧光纳米材料的抗光漂白性更好，并且通过对纳米材料表面进行修饰，还会使得材料的生物亲和性大大提高。通过调节纳米材料的尺寸可以得到发射波长较长的材料，这对降低细胞成像的背景干扰，信噪比及细胞自荧光都是有利的。
[0004]金属团簇纳米材料具有超小的颗粒尺寸具有优良的荧光性，将其负载在对细胞核内组分具有靶向材料的载体上可以进入细胞核的双层膜结构，同时荧光标记细胞核仁结构，多肽序列具有比抗体更优良的靶向特异性，设计合理有效的多肽序列，合成可对细胞核仁靶向标记的纳米金簇为研究细胞核仁及其相关过程提供更好的帮助。
【发明内容】
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[0005]本发明目的在于克服现有技术的不足，寻求一种多肽修饰的标记细胞核仁的金纳米簇及其制备方法用，降低现有细胞核仁标记材料细胞成像的背景干扰以及解决现有细胞核仁标记材料制作成本高、毒性大和制作工艺复杂的问题。
[0006]为了实现上述目的，本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的制备方法，具体工艺步骤如下:
[0007](I)用超纯水分别配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用；
[0008](2)向处理好的玻璃瓶内先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均勾，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmo 1/L ；
[0009](3)将加入反应物的玻璃瓶放置于恒温水浴锅内，70°080°(:恒温反应1211;
[0010](4)反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子颗粒物质，将离心上清液中剩余的未反应原料及小分子物质除去得到金纳米簇；
[0011]步骤(4)中离心上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一种离心沉降处理得到金纳米簇;所述KRKC的中文全称为赖氨酸一精氨酸一赖氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全称为谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。
[0012]上述方法制备的多肽修饰的金纳米簇，其粒径为1.5-2.8nm范围内，平均颗粒直径为1.9nm，金纳米簇在400nm附近有明显的吸收峰，当用400nm的激发光对金纳米簇照射时，在500-750nm区间有较强的荧光发射，发射峰在586nm附近，金纳米簇的荧光量子产率为7%。
[0013]与现有技术相比，本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的合成方法简单，操作性强，成本低，材料表面用多肽稳定，生物亲和性好，采用多肽多为稳定剂毒性低，稳定性好，发射波长，利于得到更好的核仁成像效果，此外，合成的纳米材料对细胞核仁有特异性标记，相对于比较常规的富芳环的荧光探针，这是一种全新的材料，为核仁的研究提供了新的思路与方法。
【附图说明】
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[0014]图1为本发明涉及的KRKC和GSH多肽的结构示意图。
[0015]图2为本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的透射电子显微镜表征图。
[0016]图3为本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的紫外可见吸收光谱图。
[0017]图4为本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的荧光发射光谱。
[0018]图5为本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇(A)和商品化细胞核仁探针SYT0RNA-Select(B)分别与细胞共育5小时的荧光成像效果图。
[0019]图6为本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇与商品化SYTORNA-Select分别与细胞共育之后在激光连续照射的条件下不同采集时间点成像效果对比图。
【具体实施方式】
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[0020]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明:
[0021]实施例1:
[0022]本实施例涉及的多肽修饰的金纳米簇的制备方法，具体工艺步骤如下:
[0023](I)用超纯水分别配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用；
[0024](2)向处理好的玻璃瓶内先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmo 1/L ；
[0025](3)将加入反应物的玻璃瓶放置于恒温水浴锅内，70°(:-80°(:恒温反应1211;
[0026](4)反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子颗粒物质，将离心上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤去除剩余的未反应原料及小分子物质得到金纳米簇；所述KRKC的中文全称为赖氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—赖氨酸(Lysine,K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全称为谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸(Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，购买于上海强耀生物科技有限公司。
[0027]由图1-4可知，本实施例制备得到的金纳米簇颗粒分散均匀，而且粒径分布范围相对较窄，其粒径为1.5-2.8nm范围内，平均颗粒直径为1.9nm，金纳米簇在400nm附近有明显的吸收峰，当用400nm的激发光对金纳米簇照射时，在500_750nm区间有较强的荧光发射，发射峰在586nm附近，金纳米簇的荧光量子产率为7%。
[0028]应用例1:
[0029]将实施例1制备的金纳米簇配置成400yg/ml的溶液与人纤维肉瘤细胞(HT1080)在37°C，C02含量5%的恒温培养箱内共同孵育5小时得到细胞爬片;将上述细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光扫描系统成像，成像条件100X油镜在405nm的激光激发，信号收集通道552-617nm 及662-737nm。
[0030]对比例1:
[0031]将商品化细胞核仁探针(SYTO RNA-Select，400yg/ml)与人纤维肉瘤细胞(HT1080)在37 °C，CO2含量5%的恒温培养箱内共同孵育5小时得到细胞爬片;将上述细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，用共聚焦激光扫描系统成像，成像条件100X油镜在405nm的激光激发，信号收集通道552-617nm及662-737nm0
[0032]图5为多肽修饰的金纳米簇(A)与商品化SYTORNA-Select(B)分别与细胞共育2小时的荧光成像效果对比图。可以看出多肽修饰的金纳米簇与SYTORNA-SeIect的细胞内定位相同，因此，多肽修饰的金纳米簇KCK-AuNCs可以对细胞的核仁部位进行靶向标记。图6为多肽修饰的金纳米簇与商品化SYTORNA-Select与细胞共育之后在激光连续照射条件下不同时间点成像效果的比较。如图所示，在6分钟的连续照射的成像条件下，荧光金纳米簇能够较好地维持其荧光强度，而SYTO RNA-Select的强度迅速下降，说明荧光金纳米簇对比SYTORNA Select具有更好的光稳定性。
[0033]实施例2:
[0034]本实施例涉及的多肽修饰的金纳米簇的制备方法，具体工艺步骤如下:
[0035](I)用超纯水分别配置 20mmol/L 的 HAuCl4、20mmol/L 的 KRKC 和 20mmol/L 的 GSH 溶液，将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用；
[0036](2)向处理好的玻璃瓶内先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmo 1/L ；
[0037](3)将加入反应物的玻璃瓶放置于恒温水浴锅内，80°C恒温反应12h;
[0038](4)反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子颗粒物质，将离心上清液外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一种离心沉降处理去除未反应原料及小分子物质得到金纳米簇;所述KRKC的中文全称为赖氨酸(Lysine，K)—精氨酸(Arginine，R)—赖氨酸(Lysine，K)—半胱氨酸(Cysteine，C)，所述GSH的中文全称为谷氨酸(Glutamic acid，E)—半胱氨酸 (Cysteine，C)—甘氨酸(Glycine，G)，购买于上海强耀生物科技有限公司。
【主权项】
1.一种多肽修饰的金纳米簇的制备方法，其特征在于具体工艺步骤如下: (1)用超纯水分别配置20mmol/L的HAuCl4、20mmol/L的KRKC和20mmol/L的GSH溶液，将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用； (2)向处理好的玻璃瓶内先加入450yL的KRKC溶液及150yL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液300yL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmol/L; (3)将加入反应物的玻璃瓶放置于恒温水浴锅内，70°C -80 °C恒温反应12h ； (4)反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子颗粒物质，将离心上清液中剩余的未反应原料及小分子物质除去得到金纳米簇； 步骤(4)中离心上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一种离心沉降处理得到金纳米簇;所述KRKC的中文全称为赖氨酸一精氨酸一赖氨酸一半胱氨酸，所述GSH的中文全称为谷氨酸一半胱氨酸一甘氨酸。2.—种权利要求1所述的方法制备的金纳米簇，其特征在于金纳米簇粒径为1.5-2.8nm范围内，平均颗粒直径为1.9nm，金纳米簇在400nm附近有明显的吸收峰，当用400nm的激发光对金纳米簇照射时，在500-750nm区间有较强的荧光发射，发射峰在586nm附近，金纳米簇的荧光量子产率为7 %。
【文档编号】C09K11/58GK106085420SQ201610389189
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610389189.7, CN 106085420 A, CN 106085420A, CN 201610389189, CN-A-106085420, CN106085420 A, CN106085420A, CN201610389189, CN201610389189.7
【发明人】王晓娟, 曲剑波, 王雅楠, 黄方, 何化, 王生杰
【申请人】中国石油大学(华东)