一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种利用重组脂肪氧合酶降解三苯甲烷类染料的 方法。
【背景技术】
[0002] 三苯甲烷类染料是一种多苯环化合物，使用面较广，用量也较大，其产量被列为第 三大主要染料。其中某些染料及中间降解产物具有"三致"作用。且这类染料中的一部分 难以降解，常常导致常规的生物处理系统处理效果不够理想。行之有效的染料废水处理方 法和技术是改善生态环境、保证食品安全和维护人类健康的重要保证。生物法即通过筛选 或构建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料废水的脱色，是一种经济、有效且适于大 规模废水处理的技术。
[0003] 生物方法对染料的脱色主要通过降解和生物吸附两方面发挥作用，降解是由微生 物分泌胞外氧化酶-木质素降解酶系统进行脱色，包括漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化 物酶等；而吸附主要是通过菌体的自身结构与染料等大分子物质相契合所致。因此，对用于 染料的生物脱色方法通常以微生物和酶为载体进行研宄。
[0004] LOX属于氧化还原酶，广泛存在于植物体中，它的结构中含有非血红素铁，能专一 催化含顺，顺一 1，4 一戊二烯的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子加氢，形成具有共扼双键的 氢过氧化衍生物，这些氢过氧化物性质活泼，是重要的化学反应中间体。LOX对于它作用的 底物具有特异性的要求，需要含有顺，顺一 1，4 一戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇等。 例如，LOX通过与其天然底物亚油酸作用，是处于未活化状态的酶中的还原态的Fe变成氧 化态的Fe，从而使酶激活。活化态的酶通过催化氧化亚油酸，生成氢过氧化物，不稳定的氢 过氧化物将裂解产生脂质自由基，脂质自由基具有非常高的反应活性，争夺生物分子如蛋 白质、多糖等的电子，进而造成生物分子结构的变化。
[0005] 三苯甲烷类的染料是一类带有苯环及其他侧链结构的化合物，其降解过程即是其 结构被破坏，产生无毒无害降解产物的过程。目前尚未见将脂肪氧合酶用于催化降解三苯 甲烷类染料的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的现有缺陷，提供一种重组铜绿假单胞菌脂肪氧合 酶的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种利用重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶降解三苯甲烷 类染料的方法。
[0008] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0009] 重组脂肪氧合酶rLOX-27853在降解三苯甲烷类染料中的应用，所述的重组脂肪 氧合酶rLOX-27853氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 其中，所述的三苯甲烷类染料优选孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
[0011] 所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853优选通过以下方法制备得到：
[0012] (1)从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO. 1所示的脂肪氧合酶 基因；
[0013] (2)构建脂肪氧合酶基因原核表达载体；
[0014] (3)在大肠杆菌中发酵生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。
[0015] 所述的从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQIDNO. 1所示的脂肪氧合 酶基因优选包含以下步骤：（1)提取保藏号为ATCC27853的铜绿假单胞杆菌的基因组DNA; (2)以F-2和R-2为上、下游引物，铜绿假单胞杆菌ATCC27853的基因组DNA为模板，PCR 扩增脂肪氧合酶基因；（3)回收纯化目标PCR产物；其中，所述的引物F-2序列为：SEQID NO. 5,引物 R-2 序列为：SEQIDNO. 6。
[0016] 所述的构建脂肪氧合酶基因原核表达载体优选将步骤（1)克隆得到的脂肪氧合 酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切位点得到表达质粒pET-23a-L0X-27853。将表 达质粒pET-23a-L0X-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21 (DE3)pLysS获得 重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合酶rLOX-27853。
[0017] 其中，发酵使用的发酵培养基配方为：l〇g/L乳糖，0.5g/L葡萄糖，5g/L甘 油，3. 4g/LKH2P04,1. 2g/L MgS04,10g/L 酶解酪蛋白酸钠，5g/L 酵母提取物，8. 95g/ L Na2HP04. 12H20,1. 42g/LNa2S04, 2. 67g/L NH4C1 以及 lml 微量元素混合液；所述的微 量元素混合液配方为：50 y MFeCl3. 6H20, 20 y M CaCl2. 2H20, 10 y M MnCl2. 4H20, 10 y M ZnS04. 7H20, 2 y MCoC12. 6H20, 2 yMCuC12, 2 y M NiCl2, 2 y M Na2Se03, 2 y M H3B407.
[0018] -种利用重组脂肪氧合酶rLOX-27853降解三苯甲烷类染料的方法，包含以下步 骤：
[0019] (1)以F-2和R-2为上、下游引物从铜绿假单胞菌ATCC27853菌株基因组克隆SEQ ID NO. 1所示的脂肪氧合酶基因；
[0020] ⑵将步骤⑴克隆得到的脂肪氧合酶基因插入载体pET-23a的SacI、XhoI酶切 位点得到表达质粒pET-23a-L0X-27853 ;
[0021] (3)将表达质粒pET-23a-L0X-27853通过热激法转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21 (DE3) pLysS获得重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行发酵，生产所述的重组脂肪氧合 酶 rLOX-27853 ;
[0022] (4)向含有亚油酸钠和三苯甲烷类染料的介质中加入所述的重组脂肪氧合酶 rLOX-27853对其进行降解。
[0023] 其中，所述的三苯甲烷类染料为孔雀石绿、亮绿或苯胺蓝中的任意一种或多种。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明人从铜绿假单胞菌ATCC27853基因组中，克隆获得一种新型的原核脂肪氧 合酶基因L0X-27853,以大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS为宿主菌，构建基因工程菌，通过发酵的 方法，实现了重组铜绿假单胞菌脂肪氧合酶rLOX-27853异源高效生产。重组铜绿假单胞 菌脂肪氧合酶rLOX-27853应用于高效地催化三苯甲烷类染料孔雀石绿、亮绿、苯胺蓝的降 解。
【附图说明】
[0026] 图lrLOX-27853对苯胺蓝的降解效果图（A)及降解前后全波长扫描图（B)。
[0027] 图2rLOX-27853对孔雀石绿的降解效果图（A)及降解前后全波长扫描图（B)。
[0028] 图3rLOX-27853对亮绿的降解效果图（A)及降解前后全波长扫描图（B)。
【具体实施方式】
[0029] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0030] 实施例1 :铜绿假单胞菌ATCC27853脂肪氧合酶基因（LOX-27853)的克隆
[0031] 离心收集铜绿假单胞菌ATCC27853菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取 铜绿假单胞菌ATCC278