一种延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法。本发明所提供的类组分制备方法，采用一种疏水作用与弱阳离子交换作用结合的C18/WCX型分离材料，通过不同溶剂的洗脱，在除去杂质的同时，将延胡索提取物中所含的功能活性完全不同的叔胺和季铵这两大类生物碱成分分别富集得到，使这两种类组分中总碱含量分别可达到65%和90%以上（HPLC分析）。该制备方法工艺简单，高效，回收率高，使用的分离材料也可多次反复使用，生产成本低，为“安全，有效，可控”的生物碱类组分中药制剂的开发提供了良好的技术方案。
【专利说明】一种延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物碱分离纯化【技术领域】，具体涉及一种中药生物碱类组分的制备方法。
【背景技术】
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[0002]延胡索(元胡)为S粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo ff.T.Wang的块莖,性温味苦，能活血散瘀，利气止痛，是著名的“浙八味”之一，药用价值颇高。现代药物化学和药理学实验表明，延胡索中的主要活性成分为叔胺和季铵型两类生物碱，其中叔胺碱含量约为0.65%，季铵碱含量约为0.3% (贺凯，高建莉，赵光树.延胡索化学成分、药理作用及质量控制研究进展，中草药，2007，38 (12): 1909-1912)。这两类成分不仅在结构上有差异，在溶解性和药理作用上也有着很大的不同。以延胡索甲素，乙素，丙素，丁素等为代表的叔胺型生物碱几乎不溶于水，往往具有良好的镇痛镇静作用，是延胡索用于传统止痛治疗的主要活性成分(赵翡翠，赵晓琴，李永和.醋制延胡索中延胡索乙素含量及镇痛作用的对比研究，新疆中医药，2007, 25(2):34-36);而延胡索在抗心肌缺血、减少心肌氧耗等方面的显著作用，主要是缘于水溶性较好的季铵碱(程星烨.延胡索抗心肌缺血活性部位物质基础研究，中国协和医科大学硕士学位论文，2008)。曾有文献报道，延胡素的功效与其炮制方法有关，生品与炮制品煎出液的成分相同，但炮制品中叔胺碱含量升高，止痛作用增强，而就延胡索用于治疗冠心病而言，生品则优于炮制品，主要原因就是炮制后，季铵碱含量明显降低(王光宁，李勇.炮制延胡索对延胡索乙素和去氢紫堇碱含量的影响，食品与药品，2007，9 (8): 1-2)。显然，延胡索中两类生物碱成分在治疗某一病或证时，并非都是有效的。如果能够将这两类成分分别筛选富集出来，同时也剔除其他大量的无效成分或干扰成分，在治疗某一病或证时，药效作用将更具有针对性，主要药效作用更加显著，也更容易对其质量进行控制。而目前，虽然对延胡索生物碱有效部位制剂的需求量很大，但主要都是浸膏片或经酸提碱沉，离子交换树脂等精制后的总碱，尚未有对这两类功效迥异的成分进行分类制备的方法。
[0003]有鉴于此，提出本发明。
【发明内容】
[0004]本发明为实现延胡索中不同类型生物碱成分用于治疗不同类型适应症的治疗，而提供了一种延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法。
[0005]本发明的延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法为:一、将延胡索提取物用醇含量在O?20%的乙醇水或甲醇水溶解；二、将上述得到的溶液上到乙醇或甲醇活化并用水平衡好的C18/WCX混合模式SPE柱或制备柱，首先用水或含量10%以下的醇水淋洗，除掉淀粉等极性较大的杂质，接着用10%?100%的乙醇或甲醇洗脱，得到叔胺碱组分，最后以含0.1%?10%酸的50%?100%乙醇或甲醇洗脱，得到季铵碱组分；三、将收集到的叔胺碱和季铵碱洗脱部位，浓缩后，冷冻或喷雾干燥。
[0006]本方法所得叔胺碱类组分和季铵碱类组分的高效液相色谱定性定量方法为:
[0007]Waters Alliance高效液相色谱系统，在C18ME柱上，以乙腈(A)和水(含0.1%磷酸，0.2%三乙胺)为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件为:0-20min，23%A; 20-30min, 23%_55%A；30-45min, 55%A。流速为lmL/min，PDA检测器，柱温为30°C。对于叔胺碱类组分，以延胡索乙素为对照品制作外标工作曲线，所得回归方程为y=2E+07x+9190.1，R2=0.9999，检测波长280nm，线性范围0.005-0.lmg/mL。本方法所得叔胺碱类组分中6个主峰的含量以延胡索乙素(图1，峰3)计大于65%。对于季铵碱类组分，以去氢紫堇球碱为对照品制作外标工作曲线，所得回归方程为y=5E+07x-35237，R2=0.9996，检测波长280nm，线性范围0.005-0.1mg/mL。本方法所得季铵碱类组分中7个主峰的含量以去氢紫堇球碱(图2，峰4)计大于90%。
[0008]本发明的制备方法，工艺简单，高效，制备得到的叔胺和季铵两类生物碱组分的总碱含量分别可达到65%和90%以上(HPLC分析)，纯度高，且利于质量控制，为“安全，有效，可控”的生物碱类组分中药制剂的开发提供了良好的技术方案。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1叔胺碱类组分的色谱图和6个主峰的紫外谱图。
[0010]图2季铵碱类组分的色谱图和7个主峰的紫外谱图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。实施例中所用的C18/WCX混合模式分离材料均购自浙江华谱新创科技有限公司。实施例中所得的叔胺型生物碱组分和季铵型生物碱组分均采用高效液相色谱进行定性定量分析。
[0012]实施例一:
[0013]取醋制延胡索的甲醇提取物浸膏200mg，溶于1mL 5%的甲醇水中，得20mg/mL的提取物溶液。1g C18/WCX填料(粒径40 μ m)填装于开口式SPE柱管中，先用30mL甲醇活化，然后用30mL水平衡，待用。将1mL样品倒入SPE柱上方空管，控制约2mL/min的速度上样到SPE柱上，上样完毕后，用60mL 10%的甲醇水淋洗，除去极性较大的杂质成分；接着用60mL 80%的甲醇分两管洗脱叔胺型生物碱；然后用纯甲醇冲洗至洗脱液无色，除掉其他极性较弱的非生物碱成分；最后，用含1%甲酸的甲醇洗脱季铵型生物碱至洗脱液无色(约20mL)。洗脱完后，SPE柱恢复白色，用水平衡后，可重新上样。
[0014]实施例二:
[0015]取醋制延胡索的甲醇提取物浸膏200mg，溶于1mL 5%的甲醇水中，得20mg/mL的提取物溶液。1g C18/WCX填料(粒径40 μ m)填装于开口式SPE柱管中，先用30mL乙醇活化，然后用30mL水平衡，待用。将1mL样品倒入SPE柱上方空管，控制约2mL/min的速度上样到填料上，上样完毕后，用60mL 5%的乙醇水淋洗，除去极性较大的杂质成分；接着用60mL 50%的乙醇分两管洗脱叔胺型生物碱；然后用纯乙醇冲洗至洗脱液无色，除掉其他极性较弱的非生物碱成分；最后，用含1%醋酸的80%乙醇洗脱季铵型生物碱至洗脱液无色(约50mL)。洗脱完后，SPE柱恢复白色，用水平衡后，可重新上样。
[0016]实施例三:
[0017]取醋制延胡索的80%乙醇提取物浸膏200mg，溶于1mL水中，得20mg/mL的提取物溶液。1g C18/WCX填料(粒径40μπι)填装于开口式SPE柱管中，先用30mL乙醇活化，然后用30mL水平衡，待用。将1mL样品倒入SPE柱上方空管，控制约2mL/min的速度上样到填料上，上样完毕后，用60mL 5%的乙醇水淋洗，除去极性较大的杂质成分；接着用60mL 50%的乙醇分两管洗脱叔胺型生物碱；然后用纯乙醇冲洗至洗脱液无色，除掉其他极性较弱的非生物碱成分；最后，用含1%醋酸的80%乙醇洗脱季铵型生物碱至洗脱液无色(约50mL)。洗脱完后，SPE柱恢复白色，用水平衡后，可重新上样。
[0018]实施例四:
[0019]取醋制延胡索的水提取物浸膏200mg，溶于1mL水中，得20mg/mL的提取物溶液。1g C18/WCX填料(粒径40μπι)填装于开口式SPE柱管中，先用30mL乙醇活化，然后用30mL水平衡，待用。将1mL样品倒入SPE柱上方空管，控制约2mL/min的速度上样到填料上，上样完毕后，用60mL 5%的乙醇水淋洗,除去极性较大的杂质成分；接着用60mL 50%的乙醇分两管洗脱叔胺型生物碱；然后用纯乙醇冲洗至洗脱液无色，除掉其他极性较弱的非生物碱成分；最后，用含1%醋酸的80%乙醇洗脱季铵型生物碱至洗脱液无色(约50mL)。洗脱完后，SPE柱恢复白色，用水平衡后，可重新上样。
[0020]实施例五:
[0021]取醋制延胡索的甲醇提取物浸膏lg，溶于50mL 5%的甲醇水中，得20mg/mL的提取物溶液。C18/WCX色谱柱(20 X 250mm，40 μ m),流速20mL/min，检测波长280nm，单泵上样，单泵洗脱。O-1Omin, 100% 乙醇；10-20min, 100%水；20~22.5min,上样；22.5-32.5min, 100%水；32.5-42.5min, 25% 乙醇；42.5-52.5min, 40% 乙醇；52.5-62.5min, 50% 乙醇；62.5-72.5min, 100%乙醇；72.5-82.5min, 1%醋酸-80%乙醇。叔胺型生物碱集中在40%乙醇洗脱部分；季铵型生物碱集中在1%醋酸-80%乙醇洗脱部分。
[0022]实施例六:
[0023]取醋制延胡索的80%乙醇提取物浸膏lg，溶于50mL水中，得20mg/mL的提取物溶液。C18/WCX色谱柱(20 X 250mm，40 μ m),流速20mL/min，检测波长280nm，单泵上样，单泵洗脱。O-1Omin, 100% 乙醇；10-20min, 100% 水;20-22.5min,上样；22.5-32.5min, 100%水；32.5-42.5min, 25% 乙醇；42.5-52.5min, 40% 乙醇；52.5-62.5min, 50% 乙醇；62.5-72.5min, 100%乙醇；72.5-82.5min, 1%醋酸-80%乙醇。叔胺型生物碱集中在40%乙醇洗脱部分；季铵型生物碱集中在1%醋酸-80%乙醇洗脱部分。
[0024]实施例七:
[0025]取醋制延胡索的水提取物浸膏lg，溶于50mL水中，得20mg/mL的提取物溶液。C18/WCX色谱柱(20X250mm，40 μ m),流速20mL/min，检测波长280nm，单泵上样，单泵洗脱。O-1Omin, 100% 乙醇；10-20min, 100% 水；20~22.5min,上样；22.5-32.5min, 100%水；32.5-42.5min, 25% 乙醇；42.5-52.5min, 40% 乙醇；52.5-62.5min, 50% 乙醇；62.5-72.5min, 100%乙醇；72.5-82.5min, 1%醋酸-80%乙醇。叔胺型生物碱集中在40%乙醇洗脱部分；季铵型生物碱集中在1%醋酸-80%乙醇洗脱部分。
【权利要求】
1.一种延胡索提取物中叔胺碱和季铵碱的分类制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 1)将延胡索提取物用水、乙醇水或甲醇水溶解； 2)将上述得到的溶液上样到C18/WCX混合模式色谱柱，依次采用水、乙醇水或水、甲醇水淋洗和洗脱； 3)分别收集叔胺碱和季铵碱洗脱部位，浓缩回收有机溶剂后，冷冻或喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的延胡索提取物包括以水、甲醇或乙醇中的一种或二种以上为溶剂采用渗漉、煎煮、回流、超声或微波辅助等提取方式得到的粗提物，或该粗提物再经过酸提碱沉、溶剂分配或树脂柱层析等方式净化后的总碱提取物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:所述的延胡索提取物，首先用含0%?20%甲醇或乙醇的水溶液复溶或稀释，其中，优选为0%?10%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的C18/WCX混合模式色谱柱，既可以是开口式的SPE柱模式，也可以填装于色谱柱柱管，采用制备色谱模式。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于:所述的C18/WCX混合模式色谱填料，是在硅胶基质上键合了 C18烷基链和-R-COOH的分离材料，其在具体使用之前，需先用I?5倍柱体积的甲醇或乙醇活化，再用I?5倍柱体积的含0%?20%乙醇或甲醇的水溶液平衡。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述的C18/WCX混合模式色谱柱的具体处理方式为:将所述的延胡索提取物溶液按1%?10%的上样量上样到所述的C18/WCX混合模式色谱柱，全部上样完后，用水或体积含量1%?10%的乙醇或甲醇水溶液淋洗，除掉淀粉等极性较大的杂质，接着用体积浓度10%?100%的乙醇或甲醇洗脱，得到叔胺碱组分；最后用含0.1%?10%酸的50%?100%乙醇或甲醇洗脱，得到季铵碱组分； 最后将收集得到的叔胺碱和季铵碱组分，分别浓缩，回收有机溶剂后，干燥，得到这两类生物碱。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于:洗脱得到的叔胺碱因水溶性差，生物利用度较差，可进一步在洗脱液中根据需要加入醋酸、硝酸、盐酸、硫酸等生物体系兼容的酸中一种或二种以上，使之与生物碱反应成为生理上可接受的盐，以提高溶解性。
8.根据权利要求1和5所述的制备方法，其特征在于:在季铵碱组分洗脱过程中所用的酸是甲酸、醋酸、硝酸、盐酸、硫酸等中一种或二种以上，可以根据生产的需要，使用不同的酸以得到不同的季铵碱盐；或也可以先用甲酸或醋酸洗脱后，在洗脱液中加入盐酸或硫酸等强酸来置换得到强酸盐。
【文档编号】B01D15/42GK104415573SQ201310409003
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】梁鑫淼, 王超然, 郭秀洁, 张秀莉, 郭志谋, 薛兴亚 申请人:中国科学院大连化学物理研究所