一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及其制备方法和应用。金属氧化物纳米颗粒修饰的磁性纳米材料特征为在碳纳米管（CNTs）上包裹有磁性材料，磁性材料上修饰有金属氧化物纳米颗粒。本发明的金属氧化物纳米颗粒修饰的磁性纳米材料可以对低至1×10-9M级的复杂肽段混合物中的痕量磷酸化肽段实现高选择性富集，方法简单有效。该材料及制备方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
【专利说明】一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于先进纳米复合材料和生化分析【技术领域】，具体为一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]在原核生物和真核生物的细胞活动过程中，蛋白质翻译后修饰(PTMs)是最重要的和最普遍的活动之一，而在PTMs中磷酸化几乎无处不在。它调控着包括信号传递、细胞繁殖和迁移在内的多种重要的细胞功能，约50%的蛋白质在其生命周期中发生过磷酸化修饰。而人类蛋白中至少存在着10万个磷酸化位点，蛋白质磷酸化和去磷酸化能够改变蛋白质结构、活性及其相互间的作用，从而调节如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动，被形象地描述为生理活动的分子开关。准确鉴定蛋白质中的磷酸化位点对深入理解各种生物过程的机理、探索重大疾病的生物标记物和蛋白药靶的寻找极为重要。
[0003]因其高灵敏性、高通量、操作简及可定量分析等优点，在蛋白质磷酸化行为和特性的研究中，质谱(MS)分析是一种强有力的研究工具。然而在质谱分析中，因磷酸化蛋白的低丰度，其信号经常被非磷酸化蛋白信号所覆盖。因此对复杂混合样品中的磷酸化蛋白和磷酸化肽段进行选择性富集，是蛋白质组学质谱研究所必需的。为解决这些问题，各种对蛋白和肽段有亲和力的物质和亲和性技术被广泛研究，其中最为重要且最为广泛应用的方法是固定金属离子亲和色谱法(IMAC)。在IMAC方法中，主要利用磷酸基团对于固定于载体表面金属离子的亲和力对磷酸化的蛋白或肽段进行富集分离。最新研究发现，金属氧化物纳米颗粒,如二氧化钛(TiO2)/ 二氧化铪(HfO2)和二氧化锆(ZrO2)等比传统的IMAC方法对磷酸化蛋白和磷酸化肽段的富集作用更为理想，因为其对于磷酸基团的化学吸附作用更具有选择性和可逆性。
[0004]碳纳米管(CNTs)首次发现于1991年，其在多个应用领域被大量研究。众多基于CNTs的纳米复合材料已经被报道过，如CNTs的金元素复合物等等。主要是将CNTs和功能基团/功能分子二者的物理化学性质相结合，是一种良好的功能纳米颗粒的载体。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料。
[0006]本发明的目的之二在于提供所述碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的制备方法。
[0007]本发明的目的之三在于提供所述金碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的应用。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料，在碳纳米管CNTs表面覆盖有超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒层，所述磁性纳米颗粒层表面修饰有金属氧化物MxOy纳米颗粒。
[0009]所述金属氧化物MxOy为二氧化钛、二氧化铪或二氧化锆。
[0010]一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤:
(1)将碳纳米管CNTs分散到浓硝酸中，30?50°C下反应3?5小时进行预处理，然后过滤、洗涤、干燥备用；
(2)向柠檬酸钠、醋酸钠和聚乙二醇的乙二醇溶液中，加入预处理过的CNTs和三氯化铁六水合物FeCl3.6Η20搅拌下超生反应I?2小时后，在高压反应器中150?250°C下反应10?15小时，获得超顺磁性碳纳米管材料MagCNTs ；
(3)将磁性碳纳米管材料MagCNTs在异丙醇中经超声处理后,加入二乙胺和异丙醇钛，在高压釜中200°C下反应5小时，离心分离、清洗干燥后再在400°C下进行退火反应2h，获得碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料。
[0011]一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料应用于对磷酸化蛋白和肽段的富集，包括以下步骤:
(1)将蛋白溶于NH4HCO3水溶液中，加入胰蛋白酶，370C下酶解16小时，将蛋白酶解液用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液稀释至适当浓度；
(2)取碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的悬浊液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液洗涤后加入到稀释后的蛋白酶解液，在25°C下混旋5?10分钟,用磁铁分离去除上清液,而后利用缓冲液洗涤，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来。
[0012]本发明将金属氧化物修饰于磁性纳米材料表面。首先将碳纳米管CNTs表面用超顺磁性物质Fe3O4进行包裹形成磁球，然后将金属氧化物修饰于磁球表面，形成金属氧化物纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料。
[0013]有益效果:本发明的金属氧化物纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料，作为微吸附齐U，比表面积大，且因其对于磷酸集团的选择性吸附，可对低至1X10_9M级的复杂肽段混合物中的痕量磷酸化肽段实现高选择性富集，方法简单有效，该材料及制备方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明具体实施例碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料MagCNTsOTiO2的合成示意图。
[0015]图2是本发明具体实施例碳纳米管CNTs经超顺磁性物质Fe3O4包裹后的透射电镜(TEM)0
[0016]图3是本发明具体实施例碳纳米管CNTs经超顺磁性物质Fe3O4包裹后的扫描电镜(SEM)0
[0017]图4是本发明具体实施例二氧化钛TiO2纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料MagCNTsiTiO2 的扫描电镜 SEM。
[0018]图5是本发明具体实施例二氧化钛TiO2纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料MagCNTsiTiO2复合物的透射电镜(TEM)图谱。
[0019]图6是本发明具体实施例二氧化钛TiO2纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料MagCNTsiTiO2复合物的能量色散X射线衍射(EDX)图谱。
[0020]图7是本发明具体实施例二氧化钛TiO2纳米颗粒修饰的超顺磁性纳米材料MagCNTsiTiO2复合物的广角X射线衍射(WADX)图谱。
[0021]图8是本发明具体实施例β -酪蛋白酶解液未经MagCNT@Ti02富集前的肽段的MALD1-TOF MS 图。
[0022]图9是本发明具体实施例浓度为1x10_6M的β -酪蛋白酶解液经MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF MS图。
[0023]图10是本发明具体实施例浓度为1χ10_8Μ的β -酪蛋白酶解液经MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF M图。
[0024]图11是本发明具体实施例浓度为1χ10_9Μ的β -酪蛋白酶解液经MagCNTOTiO2富集后的肽段的MALD1-TOF MS图。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0026]以金属氧化物是二氧化钛为例，本发明的碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的制备过程如下。
[0027]1、碳纳米管(CNTs)预处理:
将300mg碳纳米管(CNTs)材料分散到30?40ml浓硝酸中，30_50°C下搅拌反应3?5小时；过滤，用清水洗涤5次；45?60°C下减压干燥后备用。
[0028]2、MagCNTs磁纳米颗粒的制备:
在40ml乙二醇中依次加入0.20g柠檬酸钠、5.0g醋酸钠和0.5g聚乙二醇，搅拌；加入300mg预处理过的碳纳米管(CNTs)和810mg FeCl3.6Η20。搅拌下超生反应I?2小时。将混合物置于高压反应器中150-250°C下继续反应10?15小时。离心获得MagCNTs。
[0029]3、MagCNTsOTiO2磁纳米颗粒的制备:
将30mg磁性材料包裹的碳纳米管(MagCNTs)加入到50ml异丙醇中，超声搅拌0.5小时，得混悬液；加入0.02ml 二乙胺，继续搅拌反应5分钟；加入0.5ml异丙醇钛，继续搅拌反应5分钟；将混合物转入高压釜中，加热到200°C，继续反应5小时。降至室温，离心获得固体物，用乙醇冲洗；600C下干燥2小时；在400°C下，退火反应2小时(1.(TC /小时)，得MagCNTsOTiO2。
[0030]MagCNTsOTiO2磁性纳米材料的合成示意图见图1。
[0031]材料的表征:
UMagCNTs粒径表征:
利用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对MagCNTs磁纳米颗粒进行了表征，表征图见图2和图3。从图中可以看出碳纳米管(CNTs)被直径约为200nm的球形颗粒有序的进行了修饰，且该修饰主要发生在CNTs的两端，因两端羧基的密度最高。
2、MagCNTsOTiO2 粒径表征:利用透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对MagCNTsOTiO2磁纳米颗粒进行了表征，表征图见图4和图5。从图中可以看出数量众多的微小TiO2纳米颗粒附着在MagCNTs颗粒上，有效增大了 MagCNTsOTiO2的表面积，且没有发现粒径大的颗粒，说明二氧化钛纳米颗粒的团聚被有效地进行了抑制。从TEM中可以看出每一 MagCNTs颗粒均被一层TiO2纳米颗粒均匀的覆盖。另外，可以看出MagCNTsOTiO2复合物分散良好，无明显团聚，有利于将其应用于微量物质富集。
[0032]3、Fe，C，Ti 和 O 元素表征:
利用能量色散X射线衍射谱(EDX)对得到的MagCNTsOTiO2复合物进行了分析，见图6。从图中可以看到Fe, C, Ti和氧元素的存在。进一步说明了 TiO2成功对MagCNTs磁性颗粒进行了修饰。
[0033]4、TiOjPFe3O4 表征:
利用广角X射线衍射谱(WADX)对得到的MagCNTsOTiO2复合物进行了分析，见图7。从图中可以看到TiO2和Fe3O4的特征衍射峰。宽衍射峰信号意味着二氧化钛相的粒径极小。另外，位于26.1度处的峰为002面的衍射，表明碳纳米管(CNTs)结构在整个合成过程中被很好地保留下来。
[0034]WAXD的结果与SEM，TEM和EDX的结果一致。
[0035]将MagCNTsIgTiO2应用于对磷酸化蛋白和肽段的富集:用浓度为1x10_6M的β -酪蛋白(β -casein)胰蛋白酶酶解液考察碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料MagCNTsOTiO2的富集灵敏度。
[0036]样品准备:
β-酪蛋白25mM NH4HCOjK溶液中(pH=8.3)，加入适量的胰蛋白酶(1:50，w/w)，在37°C下酶解16小时。将酪蛋白酶解液用缓冲液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)稀释至适当浓度，这里稀释到酪蛋白酶解液的浓度为1χ10-6Μ，备用。
[0037]磷酸化肽段的富集:
取含20 μ g Fe3O4OTiO2磁化内构纳米复合材料的悬浊液(10 μ L，2 μ g/μ L)，用缓冲液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗涤三次，去除缓冲液后加入到200 μ L稀释后的β -酪蛋白酶解液，在25°C下混旋5~10分钟，用磁铁分离去除上清液，而后利用缓冲液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗涤三次。除去上清液后加入IOyL洗脱液(0.4M氨水)，在25°C下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来，以备基体辅助激光解析飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)检测分析。
[0038]利用二氧化钛(TiO2)修饰的磁性纳米材料MagCNTsOTiO2进行磷酸化肽段富集后，经基体辅助激光解析飞行时间质谱(MALD1-T0FMS)分析的质谱图见图8和图9。图8为未经处理过的酶解液，从图中可以看出，只有未磷酸化的肽段信号，而看不到磷酸化肽段的信号；图9为经过MagCNTsOTiO2富集后的图谱，可以检测出众多磷酸化肽段的信号，而无未磷酸化肽段的信号。说明该材料对于磷酸化肽段的具有优秀的选择性富集效果。
[0039]为研究MagCNTsOTiO2对磷酸化肽段的选择性富集极限和灵敏度，分别用1χ10_8Μ和1χ10_9Μ的酪蛋白(β-casein)胰蛋白酶酶解液进行了富集能力考查。见图10和图
11。从图中可以看出，即使β-casein酶解液的浓度低至1χ10_9Μ时,仍可检测到磷酸化肽段，说明材料MagCNTsOTiO2对于磷酸化肽段有很高的富集效率。
[0040]本具体实施例采用的是二氧化钛作为修饰磁性纳米颗粒层表面的金属氧化物是， 金属氧化物还可以采用二氧化铪或二氧化锆。
【权利要求】
1.一种碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料，其特征在于:在碳纳米管CNTs表面覆盖有超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒层，所述磁性纳米颗粒层表面修饰有金属氧化物MxOy纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料，其特征在于:所述金属氧化物MxOy为二氧化钛、二氧化铪或二氧化锆。
3.根据权利要求1或2所述的任一种超顺磁性纳米复合材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将碳纳米管CNTs分散到浓硝酸中，30?50°C下反应3?5小时进行预处理，然后过滤、洗涤、干燥备用； (2)向柠檬酸钠、醋酸钠和聚乙二醇的乙二醇溶液中，加入预处理过的CNTs和三氯化铁六水合物FeCl3.6Η20搅拌下超生反应I?2小时后，在高压反应器中150?250°C下反应10?15小时，获得超顺磁性碳纳米管材料MagCNTs ； (3)将磁性碳纳米管材料MagCNTs在异丙醇中经超声处理后,加入二乙胺和异丙醇钛，在高压釜中200°C下反应5小时，离心分离、清洗干燥后再在400°C下进行退火反应2h，获得碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料。
4.根据权利要求1或2所述的任一种超顺磁性纳米复合材料应用于对磷酸化蛋白和肽段的富集，其特征在于包括以下步骤: (1)将蛋白溶于NH4HCO3水溶液中，加入胰蛋白酶，37°C下酶解16小时，将蛋白酶解液用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液稀释至适当浓度； (2)取碳纳米管包覆金属氧化物晶体的超顺磁性纳米复合材料的悬浊液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液洗涤后加入到稀释后的蛋白酶解液，在25°C下混旋5?10分钟,用磁铁分离去除上清液,而后利用缓冲液洗涤，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来。
【文档编号】B01D15/08GK103559970SQ201310473851
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】曲峰, 邓春晖, 尚春庆 申请人:苏州英芮诚生化科技有限公司